实验结果ua以t细胞依赖性的方式抑制肠肿瘤生长为了研究ua依赖性自噬是否模仿了stat3△iec小鼠的效果，并以t细胞依赖性的方式阻止了肠道肿瘤的发展，研究者们采用了氧化偶氮甲烷（aom）诱导的肿瘤发生模型。fvb小鼠每周注射一次致癌物aom，持续6周，并以含ua的饲料（2.28 g/kg）或对照饲料喂养18周（图1a）。口服ua可显著降低肿瘤发生率和肿瘤大小（图1b-1d）。随之而来的是cd3+t细胞浸润到结肠黏膜的增多（图1e和1f）。结合肿瘤类器官aptk类器官（characterized by loss ofapc,trp53, andtgfbr2as well as expression of oncogenic krasg12d）系统实验，证实了ua诱导的肿瘤抑制依赖于t细胞。
图1
ua促进tscm分化线粒体重塑与t细胞命运的改变有关。考虑到ua效应对cd8+t细胞的依赖性，研究者们想了解ua是否也可能直接影响t细胞的命运。从fvb小鼠中纯化的t细胞被αcd3/αcd28珠刺激，诱导t细胞分化为效应t细胞亚群，无论ua存在与否，持续72小时。ua给药阻断了向效应t细胞的分化（图2b和2c），并导致幼稚cd44locd62lhit细胞显著增加。此外，还观察到中枢记忆细胞（tcm）的减少，而效应记忆细胞（tem）的频率保持不变。在cd4+细胞中，只观察到较晚时间点的变化，其特征是cd4+细胞的幼稚样减少，但tem细胞的频率增强。
ua通过过继t细胞转移改善肿瘤治疗
研究者们从ot-1供体小鼠（图3a）中培养t细胞48小时（ua或对照），然后过继转移到免疫缺陷rag1-/-小鼠。移植后7天，在接受了ua处理的t细胞的小鼠中，移植的cd8+t细胞的数量更高（图3b），支持增加的扩张潜力。此外，当ua条件下的ot-1 t细胞移植到具有可触及的过表达卵白蛋白aptk（aptk- ova）肿瘤的小鼠（图3c），这导致了与对照ot-i t细胞相比更强的肿瘤抑制（图3d和3e）。对肿瘤的分析显示，在ua-t细胞转移后，肿瘤中cd44表达较低，而tcf1hicd8+肿瘤浸润t细胞数量较高（图3f和3g）。这在肿瘤中符合ua诱导的记忆表型的维持。cd62l表达保持不变（图3h）。此外，与改善的记忆反应一致，接受ua预处理的t细胞的动物在tme中包含更少的tim3hipd1hi最终耗尽的cd8+t细胞（图3i）。因此，ua在过继细胞转移过程中增强了免疫介导的抗肿瘤记忆。
ua诱导t细胞的pink1依赖性自噬研究者们进一步证实，在给cd8+t细胞服用ua后6小时内，线粒体膜电位降低（图4a和4b）。这伴随着增强的溶酶体形成（图4c），24小时后，线粒体含量以剂量依赖性的方式丢失（图4d）。后者可以在所有分析的t细胞亚群中检测到，因此提示有丝分裂的诱导。图4的其他数据也有力地支持了ua诱导的依赖于pink1的自噬触发tscm的形成以增强抗肿瘤免疫的观点。
图4
ua通过pgam5胞质释放驱动wnt信号诱导tscm
研究者们共鉴定出1178个差异表达基因，其中765个表达上调，413个表达下调（图5a）。ua治疗降低了免疫检查点和效应分子编码基因的表达，而增强了cd27、ccr7和粘附基因的表达（图5b），这是干细胞样cd8+ t细胞的一个特征。另外，研究了观察到的tcf1上调是否是wnt信号增强的结果。根据这一概念，观察到几个wnt靶基因的转录增加（扩展数据图4b）。此外，ua在6小时后已经导致β-连环蛋白磷酸化显著下降（图5），表明wnt信号的激活早于转录因子的改变。图其他结果表明ua通过wnt依赖的pgc-1a上调来驱动tscm的形成，这是由pgam5在自噬反应中的囊内释放所促进的。
图5
ua促进人tscm细胞，帮助产生有效的car - tscm最后，研究者们希望确定ua是否会导致人类cd8+t细胞中tscm细胞的扩增。从健康献血者的外周血单个核细胞（pbmcs）中分离出人cd3+t细胞，并在ua存在的情况下体外用αcd3/αcd28珠刺激它们。事实上，在5 / 5个人供体中，ua增加了基于cd45ra+ccr7hicd62l+cd95+cd8+表达的人类tscm细胞的频率（图6b;图s5a和s5b）。与小鼠t细胞一样，ua处理48小时后，人cd8+t细胞显示出线粒体膜电位下降（图6c），细胞内染色证实tcf1表达增加（图6d），证实ua诱导小鼠和人t细胞的记忆干细胞特征。为了确定ua引发的自噬是否也构成了诱导car-tscm的可行策略，在存在或不存在ua的情况下，激活的t细胞通过慢病毒载体（vsv-lv）转导cd19-car基因。转导后3天，测定car -表达tscm的数量（图6e）。ua不影响基因传递到cd8+细胞；然而，尽管在ua暴露后，car-表达的tscm细胞显著增加，约占cd8+细胞的60%（图6f），但这对cd19 car- t细胞介导的nalm-6白血病细胞杀伤没有负面影响（图6g）。即使将ua应用于先前冷冻的癌胚抗原特异性car - t细胞（cea;图6h），这种强烈增强的car - tscm形成（图6i）与表达cea的人类crc类器官的杀伤效果相当（图6j）。因此，ua显著增强car-tscm细胞的增殖。在car t细胞杀伤实验中，采用了molecular devices公司的spectramax id3酶标仪的发光模式进行了数据读取。
图6
总结t记忆干细胞（tscm）表现出增强的自我更新能力和延长的生存能力，从而防止t细胞衰竭，促进有效的抗肿瘤t细胞反应。tscm细胞可以被尿石素a（ua）扩增。（ua）是由肠道微生物群系从富含鞣花丹宁的食物中产生的，已被证明可以改善线粒体健康状态。口服ua给荷瘤小鼠提供了强大的抗肿瘤cd8+t细胞免疫，而体外ua预处理的t细胞在过继细胞转移后显示出更好的抗肿瘤功能。ua诱导的tscm的形成依赖于pink1介导的自噬触发线粒体磷酸酶pgam5的胞质释放。胞质pgam5去磷酸化β-catenin，驱动wnt信号通路和代偿性线粒体生物发生。总的来说，研究者们揭示了一个连接自噬和tscm形成的关键信号通路，并认为耐受性良好的代谢化合物ua是改善免疫治疗的一个有吸引力的选择。