质粒已成为目前zui常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒dna分子。目前已有许多方法可用于质粒dna的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒dna。
碱裂解法是一种应用的制备质粒dna的方法，其基本原理为：当菌体在naoh和sds溶液中裂解时，蛋白质与dna发生变性，当加入中和液后，质粒dna分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体dna不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒dna的方法通常是利用了质粒dna相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒dna，经过*、lv仿抽提，rna酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和rna，所得纯化的质粒dna已可满足细菌转化、dna片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备
1. 溶液ⅰ: 50mm葡萄糖，25mm tris-hcl(ph 8.0)，10mm edta(ph 8.0)。1m tris-hcl(ph 8.0)12.5ml，0.5m edta(ph 8.0)10ml，葡萄糖4.730g，加ddh2o至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
2. 溶液ⅱ：0.2n naoh，1% sds。2n naoh 1ml，10%sds 1ml，加ddh2o至10ml。使用前临时配置。
3. 溶液ⅲ：*(kac)缓冲液，ph 4.8。5m kac 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddh2o至500ml。4℃保存备用。
4. te：10mm tris-hcl(ph 8.0)，1mm edta(ph 8.0)。1m tris-hcl(ph 8.0)1ml，0.5m edta(ph 8.0)0.2ml，加ddh2o至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
5.*/lv仿/异戊醇(25：24：1)
6.乙醇(无水乙醇、70%乙醇)
7. 5×tbe：tris 碱54g，硼酸27.5g，edta-na2·2h2o 4.65g，加ddh2o 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
8.溴化乙锭(eb)：10mg/ml
9.rnase a(rna酶a)：不含dna酶(dnase-free) rnase a的10mg/ml，te配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
10. 6×loading buffer(上样缓冲液)：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青ff，40%(w/v)蔗糖水溶液。
11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×tbe，微波炉加热至*溶化，冷却至60℃左右，加eb母液(10mg/ml)至终浓度0.5靏/ml(注意：eb为强诱变剂，操作时带手套)，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中(电泳缓冲液0.5×tbe)，即可上样。
二、操作步骤
1. 挑取lb固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml lb(含相应抗生素)液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜(约12-14hr)。
2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
3.将细菌沉淀重悬于100靗预冷的溶液ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。
4.加200靗新鲜配制的溶液ⅱ，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解(溶液ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。
5.加入150靗预冷的溶液ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液ⅲ为中和溶液，此时质粒dna复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时k+使sds-蛋白复合物沉淀。
6.加入450靗的*/lv仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g × 10min。
7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。
8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。
9.沉淀溶于20靗te(含rnase a 20靏/ml)，37℃水浴30min以降解rna分子，-20℃保存备用。
三、质粒dna的电泳检测
观察琼脂凝胶中dna的zui简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入dna的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与dna结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。dna吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的dna。
取制备的质粒dna 1-2靗，加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5v/cm的电压，使dna分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。
四、注意事项
本裂解法小量制备质粒 dna重复性好，一般无麻烦。若所提取质粒 dna不能被限制性内切酶切割，可通过酚/lv仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。