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基因组DNA提取纯化的注意事项

2024/5/30 3:01:53发布27次查看
组织样本 dna 纯化
大多数动物组织可以用裂解缓冲液和蛋白酶/蛋白酶 k 进行效裂解。在加入裂解液之前需要将组织切成小块,有条件的话建议使用 tissuelyser 或研钵等提前进行均质化。骨骼肌,心脏,皮肤等组织含有收缩蛋白,结缔组织和胶原蛋白,所以利用蛋白酶 / 蛋白酶 k 进行充分消化是必须的。
ffpe 样本进行 dna 纯化时需要预裂解。福尔马林可由 pbs 洗涤除去,石蜡可由甲苯和乙醇进行去除。在蛋白酶消化后提孵育的温度有助于逆转交联,以便更好的从 ffpe 组织中释放 dna,从而有助于提 dna 产量和改善下游检测性能。 从 ffpe 中得到的 dna 通常比从新鲜或冻存样本中得到的 dna 分子量小;dna 降解的程度则取决于样本类型,储存时间和固定的条件。
从微量样本中纯化 dna
微量样本中 dna 的含量很低,通常小于 5 ng dna, 通常需要使用 carrier rna 来提产量(不会影响下游分析检测)。如果需要使用 carrier rna,那么在测量 od 的时候会因为使用 carrier rna 造成浓度测量有偏差(因为 rna 在 260 nm 也有吸收)。
推荐使用 qiaamp dna micro kit 从微量样本中进行 dna 纯化,该试剂盒采用 minelute 硅胶膜柱,洗脱体积可以低至 20 μl,同时通过两步洗涤去除 pcr 抑制剂等污染物,大程度从微量样本中纯化 dna。
从血液样本中纯化 dna
血液样本可以是新鲜或冻存全血或干血片,由于血液样本在采集后会迅速凝固,所以通常在采血时使用 edta,柠檬酸盐或肝素进行抗凝。经过抗凝处理的血液样本可以直接用于 dna 纯化,需要注意的是使用的 dna 纯化方法需要能够去除上述抗凝剂,以免干扰下游 pcr 检测。全血也可以在 dna 纯化前*行白细胞富集等再进行 dna 纯化。
从血液中纯化 dna 的产量很大程度上取决于血液中的白细胞数量,而白细胞数量则和血液的供体情况有很大关联(如贫血或感染都会造成白细胞数量变化)。上述情况必须在进行 dna 纯化前就应该考虑到。此外,有些动物有有核血,这意味着这类样本中含有更多的 dna,在从此类血样中纯化 dna,上样量需要减少 10 倍左右。
从细胞中纯化 dna
哺乳动物细胞可以使用蛋白酶 k 进行裂解酵母细胞需要先使用*对细胞壁进行处理,然后使用蛋白酶或蛋白酶 k 进行消化许多**细胞可以使用裂解 buffer 和蛋白酶 / 蛋白酶 k 进行裂解,某些**如革兰氏阳性菌需要预先使用*对细胞壁进行处理**细胞需要先从生物体液中沉淀,然后从中纯化** dna,拭子样本需要先使用**剂进行预处理然后再离心使用机械裂解会比用酶消化的效果要好,尤其是针对革兰氏阳性菌或**而言
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