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人源细胞培养常用试剂

2024/3/11 16:08:01发布33次查看
人源细胞培养常用试剂
一、 pbs 磷酸缓冲盐溶液(一般作为溶剂,起溶解保护试剂的作用)
pbs 1l配方ph7.4:磷酸二氢钾(kh2po4):0.27g,
*(na2hpo4):1.42g,
加去离子水约800ml充分搅拌溶解,然后加入浓盐酸调ph至7.4,
zui后定容到1l
高温高压灭菌后置于4摄氏度冰箱保存待用。
(一般情况下,现配现用,易变质暴露在空气中)
二、 细胞消化液
0.25%*-0.02%edta的配制
配方:100ml pbs,0.25g*
步骤:
1、先配100mlpbs
2、称*0.25g
3、加入pbs中,低速搅拌 〈4h冰浴中,或者4℃过夜低速搅拌0.5h冰浴中(储存-20摄氏度冰箱中,使用保存4摄氏度)
4、调ph7.4
5、仍在冰浴中
6过滤,分装,-20℃保存,4℃短期内用完
tip:低速很重要,机械搅拌对酶是一种冲击,如果起沫,酶就变性了。低温,防止酶失活
对难消化的人源细胞:在上述配方中,加入0.02g的edta(0.02%)
tip:因为edta可以络合ca2 ,增加消化效力
注意事项:
1、*是0.25%,这是质量体积比,就是说0.25g*溶于100ml pbs,注意,尽量不要用水来溶,因为要保持渗透压。
2、edta的工作液溶度是0.02%-0.1%,根据细胞消化的难易程度自己调整。edta并不是必须的,容易消化的细胞可不加。edta对细胞贴壁性有影响,因此使用时要甚重。如果影响贴壁,但消化时必须要用,那么在用*培养基终止消化后,可离心弃上清,再加*培养基培养,可去除edta。如果对贴壁没影响,那么可不离心。
3、edta的浓度也是质量体积比。和*一起溶于pbs。
4、注意,血清可终止*的作用,但不能终止edta的作用,对有些细胞来说,终止消化后的离心是必要的。
5、*和edta在ph 为8左右的时候zui易溶解,在配制时可先滴几滴naoh将ph调至8,注意,*可使溶液变酸,所以要边溶边测ph,随时调整。注意,不可加过量naoh,否则过碱,细胞会*。
6、*edta相对比较难溶,可用磁力搅拌器,或放入4度冰箱过夜,待溶解后过滤除菌。
7、可配2-3乘的*,这样比较节约时间和滤器,用的时候对上灭菌pbs即可。
8、储存液放在-20度冰箱冻存,使用液放在4度,用的时候不要放在27度水浴锅温浴,因为这样会让*很快失效,使用前放在室温下一会,因为加的量很少,所以一般不会冻坏细胞。
9、消化时,向培养瓶中加入适量*,个人经验,一般10cm培养皿加入0.5ml足已,加入后,立刻摇晃培养皿,使*铺满,一旦铺满,立刻用*吸去多余的*,再放入37度培养箱消化。
10、注意,过量的*对细胞是有害的,而edta过多也会影响贴壁,所以没必要把细胞泡在*里面消化。
11、*37摄氏度消化效果,低于37度也有消化能力,有些容易消化的细胞在消化时甚至不需要放入培养箱。注意,不可消化过久。
三、细胞培养基
人脐静脉内皮细胞huvec细胞
培养基rpmi 1640 培养基/dmem培养基
肝癌细胞hepg-2细胞培养基
人源细胞dmem培养液(含100 u/ml-*、100 u/ml*、10%新生牛血清
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