本实验介绍了根癌农杆菌gv3101感受态细胞的制备及冻融法转化。
主要试剂
利福平，lb培养基，nacl，cacl2，yep培养基，卡那霉素
主要设备
摇床，高速离心机，低温冰箱，水浴锅
实验材料
根癌农杆菌gv3101单菌落
实验步骤
1. 根癌农杆菌gv3101感受态细胞的制备
1) 挑取单菌落gv3101，接种于5ml附加有50mg/l的利福平的液体lb培养基中，28℃，200rpm，过夜；
2) 取2ml培养物至50ml液体lb培养基中，继续培养至od600为0.5左右；
3) 将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；
4) 用l0ml 0.lmol/l冷的nacl悬浮菌体；
5) 4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；
6) 1 ml 20mmo1/l冷的cacl2悬浮，分装成50ul/管，液氮速冻后，-80℃保存。
2. 冻融法转化农杆菌
1) 冰浴融化农杆菌lba4404/gv3101感受态细胞；
2) 加入3ul表达载体质粒，冰浴30min，液氮中冻1 min，然后在37℃水浴5min；
3) 加入950ul无抗生素的yep培养基，28℃，200rpm，振荡培养4h；
4) 1 0000rpm离心1 min以浓缩菌液，用100ul yep回溶菌体；
5) 将回溶后的菌体涂于附加50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的固体yep培养基上，28℃培养36-48h。菌液pcr检测阳性克隆。