1、紧接前作《刺客信条：兄弟会》，现代刺客戴斯蒙·迈尔斯与同伴露西·斯蒂尔曼、肖恩·海斯汀及丽贝卡·克琳已在朱诺神殿寻得“第一文明”古代遗物“伊甸碎片”，而戴斯蒙于刺死露西后陷入昏迷状态并被送返基因记忆追溯机器“animus 2.0”以免精神崩溃。
2、于安全模式“黑房”中，戴斯蒙遇上第十六实验体之意识，获告悉必须进入其两名刺客祖先阿泰尔·伊本·拉哈德以及艾吉奥·奥迪托雷·达·佛罗伦萨仍未读取的记忆，使animus 2.0能把三人的记忆分开，重组其意识从而苏醒。
3、于黑房中，戴斯蒙除探索记忆也回忆自己的过去：从小在森林接受各项刺客训练，但在渴望自由下于十六岁逃走，乘坐便车到达纽约后以酒保为业，最终被跨国制药公司abstergo寻获和胁逼成为animus实验体，至此始后悔没有重视刺客的训练和承认自己乃一名刺客。
4、1511年3月，52岁的伊吉欧为了解刺客组织及目的而前往三百多年前刺客组织根据地－叙利亚城市马西亚夫，发现当年作为刺客基地的堡垒已被宿敌圣殿骑士团占领，并获悉阿泰尔在堡垒地底一密室内藏了一件遗物，其力量能够永久结束刺客与圣殿骑士团之间的战争。