10x genomics 单细胞项目一直是如火如荼，而单细胞悬液制备顺势成为该项目的关键，小编整理了晶能生物 2 年多 10x 项目经验及 10x genomics 网zhan相关资料，为你带来神秘「单细胞悬液制备」秘籍。
为保证细胞活力，新鲜的样本不能冻存且长距离运输，小编建议提前预约，公司会安排上门建库服务。上机前样本要求如下：
细胞浓度：5x105~1.2x106/ml细胞数量：1x105 cells/sample
样本制备的具体方案因样本类型而异，但无论采用哪种方案，都必须确保上样的细胞有活性。对于悬浮细胞系、磁珠富集细胞和流式分选细胞已呈悬浮状态，只需要洗涤和计数即可。固体组织和其他大细胞聚合体必须使用机械或酶解离，细胞分选或其他细胞分离技术解离成单细胞悬液状态。
样本制备一般有什么策略？ 
组织样品须通过酶促解离制成单细胞悬液细胞数量较少（小于 100 000）的样品可适当减少洗涤次数细胞直径过大的样品，可以分离细胞核，制备细胞核悬液植物细胞须去除细胞壁得到原生质体悬液
样本制备应遵循什么原则？
建议使大口径枪头重悬，以减少对细胞的损伤每次移液前先混匀细胞悬液，然后从管中部吸取弃上清时注意不要破坏细胞沉淀取样时最hao设置两个重复，对每个样品计数 2 次一般选用含 0.04 % bsa（400 μg/ ml）的 1× pbs 溶液重悬和洗涤细胞重悬细胞浓度洗涤和重悬细胞时，总体积浓度不低于 5 000 个细胞/μl；zui理想的范围保持在 700～1200 cells/ μl，此浓度下计数较为准确有些细胞如 pbmc 在 pbs 中易成团状，从而降低细胞的有效浓度，因此制备细胞悬液要迅速，最hao在 30 分钟内完成最jia上样体积为 2.5 μl～15 μl
样品质量有什么要求？
悬液干净、无过多杂质及细胞团细胞存活率>90%（比较难处理的样本可以放宽至>80%）细胞直径<40 um
若单细胞悬液中存在死亡或垂死细胞，细胞团，细胞碎片，游离 mrna 会导致：
细胞捕获率低低文库复杂性（umi 检出率下降/gene 表达量低）有效细胞 reads 数低cdna 得率偏低
如何获取高质量样品？
1. 细胞清洗：
推荐的洗涤悬浮液为含 0.04％ bsa 的 pbs，至少洗涤一次，减少细胞损失或聚。
原代细胞，干细胞和其他敏感细胞类型需最大细胞活力，必要时可用常见细胞缓冲液替换 pbs。
2. 细胞过滤：
细胞团或细胞碎片会增加微流体芯片的堵塞风险。为避免这种状况，建议在上样前使用细胞滤网（cell strainer），孔径大约为 30～40 μm，进行过滤。
低细胞悬浮液体积建议使用 flowmi™tip 过滤 , 样品体积损失小，细胞浓度降低 30% 左右。
常规体积建议使用 macs smartfilter 过滤，样品体积损失 100 ul 左右，细胞浓度影响不大。
3. 准确测定细胞活力
4. 组织优化分离方案
适宜制备时间
适宜分离条件（时间/温度/酶类型和浓度/离心转速、温度、时间）
5. 大口径移液管对细胞进行吹打，避免造成细胞损伤。
细胞计数有什么策略？
计数结果干扰会过低或过高估计细胞存活率，细胞上样浓度一般：700～1200 个细胞/µl 的范围。在次表征样品类型时，建议进行两种不同的方法计数和活力测定。
台盼蓝染色法，操作简单，但小细胞难以准确计数及活力测定荧光染料染色法，结果相对直观，计数和活力准确
如果，细胞数<100 000，样本制备应该注意什么？
样品分选至合适培养基清洗前进行一次计数水平离心机离心，pbs 至少清洗一次