宋海燕，刘 波，张骏飞，董 静，郭 远，刘利伟，陈从新
【摘要】 目的 探讨细胞因子诱导的杀伤细胞（cik）输注联合经动脉插管化疗栓塞术（tace）治疗原发性肝癌患者延缓门静脉癌栓形成的可能性。方法 选择 2010 年 1 月～2014 年 12 月我院收治的原发性肝癌患者 44 例，22 例接受 tace 联合cik 细胞输注治疗，另 22 例只接受 tace 治疗。采用ficoll 两步分离法分离外周血单个核细胞，经 ifn-γ、抗 cd3 单克隆抗体和 il-2 诱导，使用流式细胞仪检测细胞 cd 抗原表达鉴定 cik 细胞培养成功， 常规行 tace 治疗，在 tace 治疗半月后输注 cik 细胞悬液 3 次，细胞总数为 1.0×109。治疗前后行腹部 ct 检查， 确定门静脉栓子形成情况。结果 治疗后 1 m、3 m 和 6 m，联合组患者门静脉癌栓发生率分别为 4.5%、13.6%和27.2%，而 tace 组则分别为 9.0%、45.5%和 63.6%（p<0.05）；在治疗 3 月时，联合组肿瘤大小为（4.77±1.27）cm，显著低于 tace 组（[  5.54±1.14）cm,p＜0.05]；在治疗 3 月时，联合组血清甲胎蛋白水平为(83.14±31.91)  ng/ml，也显著低于 tace 组[(139.24±98.76)  ng/ml，p＜0.05]；两组肺部、颅脑和骨骼等远处转移发生率无显著性差异（p>0.05）。结论 cik 细胞输注联合 tace 可明显减缓原发性肝癌患者门静脉栓子形成的时间，改善肝功能，同时能有效控制肿瘤的生长及扩散。
【关键词】 原发性肝癌；门静脉癌栓；细胞因子诱导的杀伤细胞；过继免疫疗法；经动脉插管化疗栓塞术
  原发性肝癌是常见的消化道恶性肿瘤。研究显 示，原发性肝癌的发生率有明显上升的趋势[1]。肝癌
作者单位：230031  合肥市 第 105 医院感染病科
第一作者：宋海燕，女，33 岁，主治医师。从事肝病临床工作
患者早期无特异性临床表现，发现时多已发生肿瘤转移。由于肝脏血供丰富，且为双重血液供应，肝癌一般首先发生肝内转移，而门静脉栓子形成就是一种常见的类型。因癌栓形成后明显增加了上消化道出血的风险，给进一步治疗带来难度。因此，预防癌栓形成尤为重要。对于伴有门静脉栓子形成的肝癌患者，能耐受手术者应手术剥除治疗，并可在此基础上经肝动脉或门静脉置管灌注化疗，这是目前比较理想的治疗方法。还有其它一些微创治疗方案，如超声微波消融、放疗及门静脉内置支架等。这些治疗方法的共同缺点是无法防止肿瘤复发和转移。近年来，有学者采用细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced  killer  cells，cik）输注，作为一种全身治疗方法，可能会达到防止肝癌转移或控制远处转移灶发展的效果[2～4]。本研究采用 cik 输注联合经动脉插管化疗栓塞术 (transcatheter arterial chemoembolization, tace) 治疗原发性肝癌患者，观察治疗后门静脉癌栓形成及肝内肿块大小变化情况，发现该联合治疗能有效控制肿瘤生长，并明显降低门静脉癌栓的发生率。
  1资料与方法
1.1 一般资料 自 2010 年 1 月～2014 年 12 月我院收治的原发性肝癌患者 44 例，男性 41 例，女性 3 例；年龄 33～68 岁，平均年龄（42.6±8.3）岁。所有患者诊断符合《原发性肝癌诊疗规范（2011 年版）摘要》[5] 标准，不伴有门静脉栓子，同时无 tace 治疗禁忌证者入选。在入选患者中，接受单一 tace 治疗者 22 例，另 22 例在 tace 治疗的基础上给予静脉输注 cik 细胞悬液治疗。治疗前，两组患者各项指标比较均无显著性差异。伴有门静脉栓子或其他部位转移者或有 tace 治疗禁忌证者被除外。
1.2cik 细胞的分离、纯化和培养  采用 ficoll 两步分离法分离出外周血单个核细胞，用含血清培养基调整细胞数为 1～5×106／ml，在 37℃，5%co2培养箱中培养，于培养的第 1  d 加入终浓度为 1000u/ml 的 ifn-γ(上海沪鼎生物科技有限公司)；第 2d 加入终浓度为 100  ng/ml 抗 cd3 单克隆抗体［妙通（上海）生物科技有限公司］、1000  u/  ml 的 il-2（上海常斤生物科技有限公司），而后每隔 1～2  d加入新鲜的含 1000 u/ml 的 il-2 完全培养液，并调细胞数为 1～5×106/ml，继续培养、传代，定期补充抗 cd3 和il-2。使用流式细胞仪检测细胞 cd 抗原的表达情况。同时取培养上清行乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、hiv 和梅毒感染标志物检测，行细菌培养、真菌培养，检测抗支原体 -igg 和内毒素水平。
1.3治疗方法 所有患者每月行常规 tace 治疗 1 次，治疗组 22 例患者在此基础上接受 cik 细胞治疗，即在 tace 治疗半月后输注 cik 细胞悬液，连续或隔日输注 1 次，共 3 次，细胞总数为 1.0×109。
1.4检测与检查 常规检测血清甲胎蛋白（alpha fetal protein, afp）、血清总胆红素 (total serum bilirubin, tbil)、血清白蛋白(serum albumin, alb)和凝 血 酶 原 时 间 国际 标 准 化 比 值（international normalized ratio, inr）等。连续观察 6 个月。每次治疗前所有患者均行肝脏增强 ct 扫描，评估肿瘤大小及转移情况，并了解有无门静脉癌栓形成。
1.5统计方法 应用 spss 17.0 软件进行统计学处理，组间发生率的差异比较采用 x2 检验，两组间生化指标和肿瘤大小的计量资料以（x依s）表示，采用不 成对样本的 t 检验。p<0.05 表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1门静脉癌栓形成情况 在治疗结束后 6 个月， 两组患者门静脉栓子形成情况见表 1 和图 1。
表 1   两组门静脉癌栓发生情况（%）的比较
例数 1 m 3 m 6 m cik 22 1（4.5） 3（13.6） 6（27.2）①
 tace 22 2（9.0） 10（45.5） 14（63.6）淤p<0.05
2.2疗效情况 在治疗后，两组患者血清 afp 均有不同程度的降低；在治疗 3 月时，两组间 afp 水平差异有统计学意义（p<0.05）；在 tace 治疗后对照组肿瘤生长速度得到有效的控制，短时间内未明显增大，治疗组几乎所有患者肿瘤都停止增大，治疗 3 月时两组间肿瘤直径大小差异具有统计学意义
（p<0.05，表 2）。表 2 两组血清 afp 和肿块大小（x依s）的比较
例数 afp（ng/ml） 肿块大小 (cm)
cik 治疗前         22 142.09依103.15 5.97依1.33 治疗后 3 m 22 83.14依31.91淤 4.77依1.27 治疗后 6 m 22 85.53依33.12于 4.12依1.65盂
tace 治疗前 22 156.23依109.58 6.37依1.37
治疗 3 m 22 139.24依98.76 5.54依1.14
治疗后 6 m 21 140.03依101.13 4.95依1.34
与 tace 组比，淤t=1.759,p=0.038；于t=1.873,p=0.027；盂t= 1.826,p=0.040
2.3肝功能的变化情况 在治疗的早期，两组肝功能指标均有轻度改善。自治疗 3 月后直至随访结束，两组间血清tbil 水平差异有统计学意义（p<0.05）；血清 alb 和 inr 指标在两组间比较，差异均无统计学意义（p>0.05，表 3）。
表 3  两组血清肝功能指标（x依s）的比较 alb（g/l） tbil（滋mol/l） inr
治疗前 治疗 3 月 治疗前 治疗 3 月 治疗前 治疗 3 月治疗组 37.6依5.4 35.9依10.240.6依12.9 29.5依9.9 1.23依0.08 1.24依0.06 对照组 36.9依7.8 35.4依7.5 62.7依20.850.4依22.7 1.23依0.09 1.23依0.07
t 6.216 6.164 5.896 15.265 1.431 1.386
p >0.05 >0.05 >0.05 <0.05 >0.05 > 0.05
2.4远处转移情况 两组患者远处肿瘤转移主要发生在肺、胆管系统、胸壁、脑和腰椎，但两组转移发生率无显著性差异（p>0.05，表 4）。
表 4 两组远处转移发生情况（%）的比较
例数 1 m 3 m 4  m 5  m 6 m 治疗组 22 0（0.0） 0（0.0）   1（4.5）  1（4.5）  2（9.0） 对照组 22 0（0.0） 1（4.5） 1（4.5） 2（9.0） 3（13.6）
3讨论
cik 细胞是新近发展起来的过继免疫细胞。由于cik 细胞具有增殖速度快，抗肿瘤能力强，而且在细胞的数量上能满足临床的需要等特点，因而临床应用前景较好。目前，cik 细胞输注已广泛应用于临床疾病的治疗[6～10]，如肝癌、结肠癌、肾癌等。大量的临床研究资料显示[8]，cik 细胞输注治疗可以提高患者的免疫功能及生存质量，有助于提高疗效，延长患者的生存期。目前，使用的 cik 细胞来源有自身外周血、同种异体外周血或脐带血等。
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