疏水色谱是一款通过利用样品分子与固定相的疏水力作用的不同，用流动相洗脱时，各组分迁移速度不同而达到分离的目的的分析检测仪器。一般疏水色谱采用盐水溶液作为流动相，具有对蛋白质的回收率高、蛋白质变性可能性小等优点。由于流动相中不使用有机溶剂，因此能够保证蛋白质固有的活性，是目前较常使用的蛋白质分析检测设备。
因为疏水色谱的主要分离对象为蛋白质，而通常疏水作用色谱固定相的非极性比较弱，因此流动相多采用高浓度盐缓冲液进行梯度洗脱。并且，疏水色谱使用时的分离条件较为温和，可以避免反相色谱中由于固定相较强的疏水性和有机流动相引起蛋白质的不可逆吸附和变性，因此特别适用于活性物质的分离与纯化。
常见疏水色谱的固定相表面为弱疏水性基团，它的疏水性比反相色谱用的固定相低很多，而流动相为高离子浓度的盐溶液。蛋白质分子在这样的固定相和流动相中进行分配，蛋白质分子上的疏水性基团和固定相的疏水基团作用而被保留。当用流动相洗脱时逐渐降低流动相的离子强度，洗脱能力增强。利用被分离组分分子表面的疏水微区、变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性，配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。
蛋白质分子按其疏水性大小被依次洗脱出来，一般是疏水性较小的蛋白质分子先流出。在这样的高盐水溶液中，蛋白质不会失活。高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。这种疏水作用的大小取决于固定相和溶质的极性、流动相的组成和浓度。由于各种蛋白质表面氨基酸残基极性不同，因此有可能通过改变固定相的极性和流动相的组成从而实现分离蛋白质的目的。
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