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PCR实验出现凝胶涂布货片状条带弥散的原因

2025/12/19 17:20:15发布40次查看
pcr:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, pcr),一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊dna复制,pcr的大特点,是能将微量的dna大幅增加。pcr的原理:pcr的基本过程类似于dna的天然复制,特异性依赖于与靶序列两端互补的oligo引物。整个过程由变性-退火-延伸3个基本反应步骤构成。
pcr实验中扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散的原因如下:
(1)酶量过高。减少酶量;酶的质量差,调换另一来源的酶。
(2)dntp浓度过高。减少dntp的浓度。
(3)mgcl2浓度过高。可适当降低其用量。
(4)模板量过多。质粒dna的用量应<50ng,而基因组dna则应<200ng。
(5)引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复pcr反应。
(6)循环次数过多;增加模板量减少循环次数至30,缩短退火时间及延伸时间,或改用二种温度的pcr循环。
(7)退火温度过低。
(8)电泳体系有问题:
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大;
②凝胶没有凝固好;
③琼脂糖质量差。
(9)若为pcr试剂盒则可能:
①由于运输储存不当引起试剂盒失效;
②试剂盒本身质量有问题,如引物选择、循环参数等选择不当。
(10)降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
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