angeline lim, misha bashkurov | molecular devices llc
david egan, victor wong | core life analytics
简介
细胞涂色检验（cell painting assay）等多参数高内涵筛选方法越来越多的被应用到从药物研发到功能基因组学筛选等领域。细胞涂色检验用到多达6种荧光染料在单细胞水平来标记及观察各种细胞器。分析中获得的所有特点都能赋予指定的细胞的细胞表征。另外，通过对比新型化合物和参比化合物的表型特征能了解到作用机制。大多数生物学家都熟悉细胞涂色检验所用的方法。然而，要想在海量的实验数据中获得有意义的信息还需要计算工具的辅助。
在此，我们介绍了一种易于完成的细胞涂色检验的完整流程。通过这一方法，我们发现用同一种化合物处理的细胞表现出相同的表性特征。分层聚类分析能将紫杉醇和鱼藤酮之类的高毒性化合物分到同一组。氯喹和粉防己碱这两种影响自噬的化合物同样被分到同一组里。这些结果表明此处提出的工作流程是开展高内涵表型分析可行且可靠的方法。
方法
基于图像的分析工作流程概述。以下列出了每个步骤的详细信息。
1、u2os细胞（atcc）按每孔2000个细胞接种。
2、总共测试了11中化合物，每种化合物按照1:3梯度稀释（共7个浓度），每个浓度4个复孔，同时加入合适的对照。化合物如下：ca-074-me，羰基氰化物间氯苯腙（cccp），氯喹（chloroquine），细胞松弛素d（cytochalasin d），依托泊苷（etoposide），拉氏菌素b（latrunculin b），雷帕霉素（rapamycin），鱼藤酮（rotenone），十字孢碱（staurosporine），紫杉醇（paclitaxel）和粉防己碱（tetrandrine）。
3、化合物处理24小时后，根据bray等人的实验方案用细胞涂色染料对细胞进行染色。包括以下染料：mitotracker deep red，wheat-germ agglutinin/alexa fluor 555，concanavalin a/alexa fluor 488，phalloidin/alexa fluor 568，syto14和hoechst 33342。
4、用美谷分子仪器的imagexpress®显微共聚焦高内涵成像系统（imagexpress®micro confocalhigh-content imaging system（molecular devices））进行图像采集，物镜为20× plan apo objective，激发/发射滤光片如下：dapi 377/447，fitc 475/536，tritc 543/593，texas red 560/624，cy5 631/692。
5、用in cartatm图像分析软件进行图像分析。选择的280个测量值包括跟强度、纹理、形状、空间关系及共定位评分相关的参数。
6、细胞级数据已上传至stratominertm进行进一步数据分析。简言之就是实施了质量控制、微孔板正规化、数据转换以及特征标准化。用主成分分析（principal component analysis，pca）降低数据集的维度。进一步的下游分析，例如命中选择及聚类分析，则基于主成分和推导的表型距离评分。
结果
血管生成建模
在我们的模型检测中，u2os细胞用11种化合物处理24小时，之后按照以前发表的实验方案处理。用imagexpress显微共聚焦系统进行细胞成像（图1）。
图1. 细胞涂色检验。细胞经化合物处理，染色然后成像。对照孔各个采集通道的成像示例。最后一个图片展示了肌动蛋白、内质网和细胞核的复合图像。
特征提取
使用in carta软件，可调整图像分析程序以实现细胞及细胞器的可靠检测（图2）。深度学习语义分割模块（sinap）可以用来提升挑战性特征的检测。预训练的深度学习模型可用来检测细胞核或细胞。或者，用户也可以根据自己感兴趣的特定对象来训练新的模型。
图2. in carta软件中的特征提取。a）在in carta软件中建立分析实验方案来分割各个细胞结构。此处我们用内置的细胞核模型实现了所有处理的细胞核的有效分割。其他细胞特征包括细胞质区域、肌动蛋白丝网络、内质网及线粒体也得到了分割。在设定分析时选择了跟强度、纹理、共定位和形状相关的测量值。在实验方案中我们共选择了细胞及亚细胞结构的280个测量值。b）in carta软件中带有特征掩饰叠加的图像示例。
数据分析工作流程
将in carta软件中获得的测量值上传至hc stratominer进行进一步数据分析（图3）。
图3a-b. 利用hc stratominer进行数据分析。a）hc stratominer是一个基于网络的平台，能通过典型的工作流程指导用户进行高内涵多参数数据分析。b）qc步骤的散点图。x轴代表了所有样本，y轴代表了选中的特征（细胞核区域）。
图3c-d.利用hc stratominer进行数据分析。c）主成分分析（广义加权最小二乘法）将数据减低至15个成分。对pca4的特征贡献以极坐标图显示。d）3d散点图显示了数据点与3种不同pca之间的互作。
表型特征比较-聚类
距离分数根据选定的主成分分数进行计算。这一分数代表了样本与阴性对照之间的表型距离，能用于筛选分析中的命中选择。随后，可基于选中的特征或成分进行分层聚类分析。
用同一种化合物处理的细胞聚类到一起（图4a，簇9,10）。已知具有相似细胞效应的化合物也聚类到一起。肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素d和拉氏菌素b共同存在于簇6中。在自噬信号通路中有作用的粉防己碱和氯喹也聚类到一起（图4b）。
图4. 聚类分析。a）树状图代表了分层关系。属于相同簇的孔（编号）用彩条表示。每个孔基于距离分数的p值展示了出来。注意，簇9仅由十字孢碱处理的细胞组成，而簇10仅由依托泊苷处理的细胞组成。b）属于某些簇的化合物处理的细胞示例。簇5由粉防己碱和氯喹处理的细胞组成。两者处理的孔中内质网点都有增加。簇4由鱼藤酮和紫杉醇处理的细胞组成，这些孔中的部分细胞有起泡出现。表明了细胞毒性作用。
基于表型特征的剂量-反应建模
图5.剂量-反应曲线。使用从命中选择步骤获得的表型距离分数绘制ic stratominer中每一种化合物剂量反应曲线。y轴代表了表型距离，x轴代表浓度。
结论
我们的结果表明利用imagexpress显微共聚焦系统、in carta软件和stratominer实现基于图像的分析的可行性。
in carta软件结合了易用性及更高级的特征分割选项（sinap），可实现细胞特征的可靠分割。
stratominer平台允许非专家用户根据直观的引导式工作流程进行快速的表型数据分析。
参考文献
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