虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,sap)催化dna和rna 的5’和3’磷酸单脂的去磷酸化反应,也可水解核糖和脱氧核糖核苷三磷酸(ntp 和 dntp)。该酶在分子生物学研究中应用广泛,如去除dna和rna 末端的磷酸基团,用于后续的克隆和探针末端标记。在克隆中,载体经虾碱性磷酸酶去磷酸化后5’ 端无磷酸基团,因而不可以和自身3’ 端连接。虾碱性磷酸酶可作用于5’突出端、凹陷端和平末端,也可用来降解pcr反应中的游离dntp,用于制备测序模板和snp分析。该虾碱性磷酸酶在65℃温育5分钟即可完-全的、不可逆的失活,因此,在连接或末端标记之后,可以不用去除。基于以上特性,该酶是传统去磷酸化酶--小牛肠碱性磷酸酶的替代物。
应用
dna 和 rna 的去磷酸化
防止克隆载体的自连
制备5´末端标记模板
去除 pcr 产物中的 dntp 和焦磷酸盐
活性定义
1单位指在25℃条件下,30分钟能使1μg经 hindiii(产生5’突出末端)消化的 puc19 dna 去磷酸化所需的酶量。去磷酸化标准是指在自连接反应中能抑制>95%的dna 再连接。
使用注意事项
(1)1×sap buffer:50 mm bis-tris hcl ph 6.0,1mm mgcl2,0.1 mm zncl2,25℃ 温育。
(2)热失活:65℃ 加热 5 分钟,不可逆失活。该酶通常用于酶切载体的去磷酸化,因其不可逆热失活特性。当完成去磷酸化反应后,无需再纯化产物,可以直接用于后续连接反应。
(3)虾碱性磷酸酶也可以用来降解pcr反应中的游离dntp,用于制备测序模板和 snp 分析。同样无需纯化,可直接用于下游实验。
