1 材料与方法
1.1 材料
供试烟草种子来自云南省昭通、曲靖陆良、玉溪江川、曲靖寻甸、红河、楚雄、丽江、曲靖陆良等8 个主要烟草种子生产基地。培养基和pda 培养基。
1.2 方法
1.2.1 烟草种子内部真菌带菌检测 将烟草种子在75% 的酒精浸泡3 min，然后在1 j 的升汞浸泡3min，zui后用无菌水漂洗3 次。将消毒后的烟草种子按4 *4 方阵排列均匀摆放在直径9 cm 的培养基平板上，每个处理10次重复。在28e培养箱中12h光照/黑暗交替下培养5~ 7 d，检查、记录种子的真菌带菌情况。
1.2.2 真菌鉴定 将分离到的各种真菌转移到pda培养基进行纯化、转管保存、镜检。根据真菌培养性状和形态特征， 参考有关工具书和资料鉴定。
2 结果与分析
2.1 烟草种子内部的真菌带菌率来自不同产地的烟草种子真菌带菌情况有较大的差异。其中来自昭通和曲靖陆良的烟草种子带菌率较高， 分别达到16.25% 和11.25%； 而来自大理和红河的种子带菌率相对较低，只有0.625%和1.25%； 来自楚雄的烟草种子中未能检测到带菌。
2.2 烟草种子内部带菌微生物种类和带菌率及其培养中出现的频率检验结果表明，烟草种子内部携带真菌种类有链格孢菌（ alternaria alternaaata） 、镰刀菌（ fusairium spp） 、腐霉（ pythium spp） 、芽枝孢菌（ cladosporium spp） 等4 种类型。不同产区的烟草种子所带的真菌种类差异不大， 链格孢菌在培养的携带真菌中出现的频率比较高， 来自昭通、曲靖陆良、红河、大理等产地的为， 曲靖寻甸、玉溪江川、丽江等产地的均超过50% 。从玉溪江川产地的烟草种子内部还分离到cladosporium spp， 从曲靖寻甸产地分离到fusairium spp， 从丽江产地分离到fusairium spp 和pythium spp， 这些表明种子产地来源和携带的真菌种类有一定的相关性。
3 讨论
本试验采用平板培养检测烟草种子内部携带的真菌， 可较好地检测烟草种子内部真菌带菌状况， 多次重复， 重现性高； 而且所用培养基为已商业化生产的虎红琼脂。因此， 可以利用统一的培养基、统一的操作规程对烟草种子内部进行真菌带菌检测。固这种方法可推荐作为云南及全国烟草种子健康检测的一个标准方法之一。
本试验结果表明， 来自昭通、曲靖陆良、玉溪江川、曲靖寻甸、红河、楚雄、丽江、大理等云南主要烟草种子基地的烟草种子内部真菌带菌有较大差别， 而带菌的主要真菌种类差异不大。烟草内部真菌带菌的主要种类为链格孢菌， 其他还有镰刀菌、腐霉和芽枝孢菌。链格孢菌是引起烟草主要叶斑病害、赤星病的病原， 烟草种子内部携带该菌的检出可能与烟草种子田间生产过程中感染赤星病有关。因此， 在烟草种子田间生产过程中应加强对赤星病的防治以减少烟草种子携带真菌， 特别是病原真菌。至于烟草种子携带的链格孢菌是否会成为下年度烟草赤星病的初侵染源尚待进一步研究， 而且确定烟草种子携带链格孢菌的量达到什么程度时需要进行种子消毒处理， 对种子的加工具有重要的指导作用。
烟草种子内部携带镰刀菌、腐霉和芽枝孢菌， 而这些真菌本不是烟草叶部病害的病原菌， 这些真菌是通过何种途径（ 如在烟草蒴果果皮上定殖、种子晾干过程中受潮等） 进入烟草种子内部（ 种皮） 的也需要进一步明了。
实验后续，经过实验的种子再继续用液晶显示种子x光机观察烟草种子内部虫害中心空洞、胚芽的发育情况、大小、形状、数量，其生长状况一切良好，优于未经实验处理的烟草种子。