含挥发性脂肪酸的样液，在加热的条件下，与酸性乙二醇作用生成酯，此酯与羧胺反应，形成氧肟酸。在高铁试剂存在下，氧肟酸转化为高铁氧肟酸的棕红色络合物，其颜色的深浅在一个较大的范围内与反应初始物——挥发性脂肪酸的含量成正比，故可用比色法测定。
2、测定方法
⑴ 试剂
① 1：1硫酸：浓硫酸（相对密度1.84，c.p.）加到同体积蒸馏水中稀释配制。
② 酸性乙二醇试剂：取30.0ml乙二醇(c.p.)与4.0ml配制的稀硫酸混合。
③ 4.5mol/l的氢氧化钠：称取180g氢氧化钠(c.p.)溶于水中，冷后以蒸馏水稀释至1l。
④ 10%硫酸羟胺溶液：称取硫酸羟胺(c.p.)10.0g，溶于100ml蒸馏水中。
⑤ 羟胺试剂：量取20.0 ml4.5mol/l的氢氧化钠，与5.0ml10%的硫酸羟胺相混合。
⑥ 酸性氯化铁试剂：将20.0g分析纯fecl3 ·6h2o溶于500ml水中，准确加入20.0 ml浓硫酸，并以蒸馏水稀释至1l。
⑵ 测定程序
① 乙酸标准液的配制。精确称取乙酸（分析纯，相对密度1.045，含量99.0%）1.010g，以蒸馏水稀释至100ml，此溶液含乙酸10mg/ml。
准确吸取10 mg/ml乙酸标准溶液1.0ml、5.0ml、10.0ml、15.0ml、20.0ml、25.0ml、30.0ml，分别置于100.0ml容量瓶内，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得100μl/l、500μl/l、1000μl/l、1500μl/l、2000μl/l、2500μl/l、3000μl/l的乙酸标准系列液。
② 标准曲线的绘制。取相对密度1.045的乙酸（分析纯）试剂，制成50ml/l、100 ml/l、500 ml/l、1000 ml/l、1500 ml/l、2500 ml/l、3000 ml/l的系列标准液，分别吸取0.5 ml分置于试管中（12.5cm×1.5cm），每瓶中准确加入，于沸水浴中加热3min，然后立即以冷水冷却；再加入2.5ml羟胺试剂，充分摇匀，然后，充分振荡混匀，以蒸馏水定容，用721型分光光度计以500nm波长测定其光密度，绘制标准曲线，以横坐标表示浓度值，纵坐标表示光密度值。
③ 样品的测定。以4000～10000r/min的离心条件，制取沼气发酵样品澄清液，吸取0.5ml样液置于试管中（12.5cm×1.5cm），准确加入1.7 ml酸性乙二醇试剂，充分混合，于沸水浴中加热3min，应避免试管与加热器壁直接接触。然后立即将试管置于冷水中冷却。加入2.5ml羟胺试剂，并混匀，放置1min，然后全部倒进盛有10ml酸性氯化铁试剂的25ml容量瓶中，用蒸馏水定容，并充分摇匀，静置5min，用分光光度计以500nm波长测定光密度。同样操作做空白试验1份。 计算
3、注意事项
① 此方法是挥发性脂肪酸总量的经验测定法，比蒸馏法测定更为简便、快速。除150mg/l以下的低浓度范围外，其测定值相对误差与气相色谱法测定总值的相对误差相近。
② 此法中的反应是在严格的ph值条件下进行的，ph值为1.6±0.1。ph值高于2.0时，色度加剧，ph值低于1.0时，颜色难以稳定，易消失。
③ 酸性己二醇试剂和羟胺试剂宜使用时配，也可在测定中配入。例如，以加入1.5ml己二醇和0.2ml稀硫酸来代替1.7ml酸性己二醇试剂，以0.5ml硫酸羟胺和2.0ml4.5mol/l的氢氧化钠来代替2.5ml羟胺试剂。
④ 如果所做的空白测定含量酸量超过200mg/l时必须用氢氧化钠蒸馏提纯己二醇 。
⑤ 酸性氯化铁配制好后，应静置过夜，弃去沉淀。
⑥ 必须严格遵守操作规程，显色反应必须充分摇动。
⑦ 比色法没挥发性脂肪酸总量，方便快速，对于特定样品（特别是污水污泥体系）的准确度较高，适合于沼气发酵的常规分析。