1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
鹰嘴豆，大漠盛宴旗舰店; 甾醇标准品 ( *、 胆甾烷醇、菜籽甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、菜油甾烷 醇、豆甾醇、β-谷甾醇、δ7-燕麦甾烯醇、豆甾烷醇、δ5- 燕麦甾烯醇) ，美国 sigma 公司; 衍生剂 n-甲基-n-基 硅烷基七氟丁酰胺∶1-甲基咪唑 ( 95∶5，v / v) ，美国 sigma 公司; *、*、脂肪酶、猪胆盐，美国 sigma 公司; 正己烷、二氯甲烷、丙酮为色谱纯; 盐酸、、石油醚、乙醇均为分析纯，北京蓝弋公司。
1. 2 仪器与设备
freezone 冷 冻 干 燥 机，美 国 labconco 公 司; jyl-b063 九阳料理机，山东九阳股份有限公司; ser148 全自动脂肪测定仪，北京盈盛恒泰科技有限公司; mdf382e ( n) 超低温冰箱，日本 sanyo 公司; fw100 高速 粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司; fa1004 电子 天平，上海越平科学仪器有限公司; 全波长酶标仪，美国 thermo 公司; 其林贝尔ql-901 涡旋振荡器，江苏其林贝尔 仪器制造有限公司; nk200-18 可视孔氮吹仪，杭州米欧 仪器有限公司; tgl-16 台式高速冷冻离心机，湖南湘仪 离心机仪器有限公司; hh-8 电热恒温水浴锅，上海棱光 技术有限公司; 气相色谱-质谱联用仪 ( gcms-tq8040) ， 日本 岛 津 公 司; 硅 胶 固 相 萃 取 小 柱 silica 0. 5 g /6ml ( spe) ，北京迪马公司; hh-8 电热恒温水浴锅，上海棱 光技术有限公司; p70d20tl-d4 微波炉，广东格兰仕微波 生活电器制造有限公司; hiperbaric-135 超高压非热杀菌 设备，东莞市莱曼五金机械有限公司。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 鹰嘴豆预处理
将鹰嘴豆粉碎，置于 － 80℃ 超 低温冰箱中进行预冻处理，之后冷冻干燥48 h 以除去粉 末中剩余水分，于 － 20℃低温冻藏备用。
1. 3. 2 鹰嘴豆中油脂的提取
取 1 ～ 3 g 经 1. 3. 1 预处 理并冻存的鹰嘴豆粉末放于滤纸筒，滤纸筒放入提取筒 中，加入 30ml 石油醚。将提取筒放入自动脂肪提取仪， 65℃加热 1 h，提起提取筒，65℃继续抽提 1. 5 h，差量 法获得油脂数据。将油脂于 － 20℃保存备用。
1. 3. 3 鹰嘴豆中游离甾醇的提取
取 50 mg1. 3. 2 所制 备的油脂样品，加入 20 μg 胆甾烷醇内标，用 5ml 正己 烷溶液溶解，涡旋振荡均匀，备用。称取 1. 0 g 无水硫 酸钠加到固相萃取小柱的上方，然后用 10ml 正己烷溶 液活化，流速 1. 5ml/min，弃去流出液。将 5ml 样品液 注入到固相萃取小柱中，控制流速 1. 2ml/min，弃去流出液。用 10ml 体积分数 5% -正己烷溶液进行淋洗， 除去甘油三酯和甾醇酯类化合物，流速控制在 1. 2ml/ min，弃去流出液。用 10ml 体积分数为 20% -正己 烷溶液洗脱游离甾醇并收集于洁净干燥的试管中，流速 控制在 1. 5ml/min。氮吹吹干有机相，4℃贮藏备用。
1. 3. 4 鹰嘴豆中总甾醇的皂化和提取
取 50 mg1. 3. 2 所制备的油脂样品，加入 20 μg 胆甾烷醇作为内标，加 入 2mol /l 氢氧化钾-乙醇溶液 4ml，二氯甲烷 0. 5ml， 涡旋振荡 1min 混匀。25℃ 水浴振摇 18 h。加入二氯甲 烷 5ml，超纯水 3ml，轻轻混合均匀以免产生泡沫，去 除上清后，再用 5ml 超纯水清洗 3 次，弃上清，氮吹吹 干有机相，4℃贮存备用。由总甾醇和游离甾醇相减得 到结合甾醇含量。
1. 3. 5 鹰嘴豆中结合态甾醇含量的测定
由总甾醇含 量减去游离甾醇含量得到每种结合态甾醇的含量。
1. 3. 6 鹰嘴豆中植物甾醇的分析鉴定
( 1) 色谱条 件: 载气: 氦 气 ( 纯 度 99. 999% ) ; 色 谱 柱: db-5ms 色谱 柱 ( 30m × 0. 25mm × 0. 25μm) ; 进 样 口 温 度: 290℃; 分流进样: 20∶1; 进样量: 1μl; 流速: 1. 2ml/ min; 程 序 升 温: 初 始 温 度 100℃ ( 保 持 1min) ，以 40℃ /min 升至290℃ ( 保持15min) 。
( 2) 质谱条件: 电 离方式: ei; 电离能量: 70 ev; 离子源温度: 250℃; 传输线温度: 290℃; 监测方式: sim 模式。
( 3) gcms 检测: 称取各甾醇标准品 5mg ( β-谷甾醇 10mg) ， 分别 用 丙 酮 配 置 浓 度 梯 度 为 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、 0. 5mg /ml 的甾醇混合标准溶液，氮吹吹干。将上述制备 的甾醇混合标准溶液、1. 3. 3 和 1. 3. 4 提取的甾醇样品中 均加入 100 μl 衍生剂于 75℃衍生 20min，正己烷定容到 1ml，进样 1 μl 用 gc-ms 检测。样品中所含有的植物甾 醇定性鉴定采用与甾醇标准物质保留时间的比对及质谱 库检索的方法进行。样品中植物甾醇定量分析采用内标 法，依据总离子流色谱图峰面积计算每种甾醇的含量。
1. 3. 7 鹰嘴豆热处理
按 1∶1 ( m/ v，g /ml) 比例加入 鹰嘴豆和超纯水，于 4℃下泡豆 6 h。取适量浸泡好的鹰 嘴豆倒入烧杯中，按上述比例加入超纯水。80℃水浴加 热，期间不断搅动，使鹰嘴豆受热均匀，分别在 2、6、 10、30、50min 等 5 个时间点对鹰嘴豆取样。匀浆后， 4℃贮藏备用。
1. 3. 8 鹰嘴豆微波处理
取适量按 1. 3. 7 方法所浸泡 好的鹰嘴豆倒入烧杯中，按 1∶1 ( m/ v，g /ml) 比例加 入超纯水。微波加热处理，额定功率 350 w，分别在 1、 2、6、10、15min 等 5 个时间点对鹰嘴豆取样。匀浆后， 4℃贮藏备用。
1. 3. 9 鹰嘴豆超高压处理
取适量按 1. 3. 7 方法所浸泡好的鹰嘴豆，按 1∶1 ( m/ v，g /ml) 比例加入超纯水， 匀浆处理。将鹰嘴豆匀浆分装于耐高压包装袋中，分装 完成后用真空封口机封口，尽量避免样品与热封机封口 条接触。将分装好的样品放入高压反应釜中，浸没于传 压介质 ( 本试验为水) 中，在 20℃、压力 400mpa 下进 行处理，分别在 1、2、6、10、15min 等 5 个时间点对鹰 嘴豆取样。压力升至设定压力时开始计时，到达处理时 间后设备自动泄压，超高压处理结束后，将样品立即放 入冰浴中冷却，于 4℃贮藏备用。
2 结果与分析
结合甾醇所占比例较小。与其他研究结果相 比，本研究利用固相微萃取方法提取分离出鹰嘴豆中总 游离甾醇，并对其种类和含量进行分析鉴定，所获得的 研究结果对鹰嘴豆中植物甾醇的存在形态给出了明确的 结果，这对鹰嘴豆中所含有的营养成分进行了有力的补 充，从而促进鹰嘴豆在药食同源中的广泛应用。而具体 的结合态甾醇存在形式还需做进一步分析验证。与其他 豆类相比，鹰嘴豆中植物甾醇总量和红豆相似，低于大 豆、绿豆、黑豆等植物甾醇总量 。韩军花在对不 同豆类中总甾醇含量进行分析时，发现植物甾醇含量可 能与豆类中碳水化合物的含量有关，碳水化物含量高的 豆类中植物甾醇含量相对较低。与对照组相比，对鹰嘴豆匀浆热处理 2min 时，植物甾醇的生物接近度略微升高，但升高幅度 不显著，之后随加热时间的延长，植物甾醇生物接近度 持续显著地下降。当处理时间达 30min 后，生物接近度 不再发生显著变化。许多研究表明，食物在经过热加工 后，由于食物基质和颗粒遭到一定的破坏，会促进营养 素的释放，从而增加营养素的生物接近度。不过也有一 些研究表明，热加工过程对某些营养素生物接近度增加 不明显，甚至还会降低，比如 rock 等研究发现， 热加工处理降低了胡萝卜和菠菜中 β-胡萝卜素的生物接 近度。试验结果表明，对鹰嘴豆短时间的热处理会一定 程度提升甾醇的生物接近度，但是随着热处理时间的延 长，植物甾醇的生物接近度将显著下降，这可能是因为 轻微的加热促进甾醇从食物基质中释放出来，有助于甾 醇胶束化结构的生成。而过度长时间加热可能导致鹰嘴 豆细胞结构被破坏，使甾醇在胃肠液中被迅速消化降 解。也可能是因为破坏了甾醇胶束化结构的稳定性，导 致胶束化率降低，从而影响其在人体内的吸收。研究结 果表明，在鹰嘴豆食用过程中，进行较短时间的热处理 有利于保持其中植物甾醇的生物接近度。
3 结论
利用 gc-ms 方法分析了鹰嘴豆油脂中植物 甾醇的种类、含量及存在形态，并对经加热、微波及超 高压处理的鹰嘴豆中植物甾醇生物接近度变化情况进行 了研究。结果表明，鹰嘴豆中主要含有 β-谷甾醇、菜油 甾醇、δ5-燕麦甾烯醇、豆甾醇、豆甾烷醇、δ7-燕麦甾 烯醇，此外还含有微量的*和菜油甾烷醇。所鉴定 出的上述 8 种植物甾醇中均主要以游离甾醇形式存在， 结合甾醇所占比例较小。体外模拟消化实验表明，鹰嘴 豆中植物甾醇的生物接近度较低。加热、微波及超高压 处理均会导致鹰嘴豆中植物甾醇生物接近度不同程度的 下降，食用过程中可以采用较短时间的热处理或者微波 处理来降低植物甾醇生物接近度的下降。
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