暗场显微镜的主体与普通明场显微镜一样，*的不同在于照射到被检物体上的光线发生了变化，普通的显微镜都是通过垂直的照射的方式直接照射于被检物上，然后通过物镜与目镜对被检物进行成像，暗场显微镜的诞生对于观察十分微小的亚粒子有着很大的帮助，尤其适用于观察溶质粒子的布朗运动原虫、细菌的鞭毛、伪足运动以及人体体液中螺旋体、尿管形、结晶或各种粒子。
如图，暗场显微镜的聚光镜与普通显微镜聚光镜不同，它的作用是使光线成一个锥形照射到被检物上。同时暗场显微镜的照明中，为了达到只让光线从侧面照射被检物体的目的，需要用一块遮光板置于备件物体的光轴处，这样就虑掉了垂直入射光而只有侧面的光通过了，如果载物台无样品，而聚光镜的数值孔径又大于物镜，那么这个中空的锥形光束就无法进入到物镜里面，这就是为什么暗场显微镜下观察时背景为黑色的原因。此时若在载物台上放置被检物，锥形光束照在被检物上，在样品的表面或内部发生反射、衍射和折射，改变了照在物体上光路的方向，使光线进入到物镜里而成像，下面是在暗场的情况下拍摄的照片：