spe-ti-imac, 99%
中文名称：
固相萃取固定化亲和色谱微球
保存条件：
室温储存，保质期为五年。
适用范围：
本产品适用于对磷酸肽的鉴定和富集。
自备材料：
•样品：蛋白酶解液
注意：蛋白酶解液中不能含有干扰磷酸肽富集的物质，如 edta等络合剂、含磷酸根的缓冲盐！
•loading buffer：80%acn / 6%tfa水溶液
作用：将酶解液酸化，高浓度的 tfa-可以抑制酸性肽段的残留
•wash buffer 1: 50%acn / 6%tfa / 200 mm nacl水溶液
作用：洗涤非特异性吸附的肽段，盐可以抑制非磷酸肽的残留。
•wash buffer 2：30%acn / 0.1%tfa水溶液
作用：洗涤残留的 wash buffer1中的盐。
•elution buffer：10%氨水溶液
•耗材：200 μl枪头、600 μl离心管、1.5 ml离心管、直径为 1 mm的筛板
•tip柱准备：
(1)将 1 mm的筛板填入 200 μl枪头中，如图 1a-b所示，尽可能填的靠近枪头的底端。
图 1
(2)如图 2所示，将 600 μl离心管剪开，在离心管盖中间打孔，使 200 μl枪头可以卡在图 1c所示位置；
如图 2
(3)如图 1d所示，1 ml离心管剪掉盖子作为套管，然后在 200 μl的枪头中加入适量已螯合 ti4+的 spe-ti-imac材料，tip柱制作完成，如图 3所示。
如图 3
注意事项：
本产品 spe-ti-imac材料未螯合 ti4+，首先应先将 ti4+螯合到材料上，然后再进行磷酸肽富集。
200 μl枪头一般建议最多装 10 mg spe-ti-imac材料，如果样品起始量较大，请按比例增加 spe-ti-imac材料使用量。当材料使用量为 100 mg以下，可以使用柱管体积为 1 ml的 spe柱管及其对应筛板；当材料用量为 100-200 mg时，可使用柱管体积为 3 ml左右的 spe柱管及其对应筛板。
实验步骤：
一、 spe-ti-imac材料的 ti4+螯合
1、按照 spe-ti-imac材料:硫酸钛 ti(so4)2 = 1:50 (m/m)，称取材料和硫酸钛。以称取500 mg材料为例，将 25 g硫酸钛固体加入 50 ml平底离心管中，加入纯净水至 40 ml，超声溶解 (注意：硫酸钛在溶解过程中会放热，请缓慢加入)。向硫酸钛溶液中加入 spe-ti-imac材料，混匀，置于 rolling incubator上摇匀，室温过夜，请勿磁力搅拌。
注意：可按照实际制备情况酌情称取材料和硫酸钛，建议 spe-ti-imac材料不要低于 500mg。
2、次日，将步骤 1中的 spe-ti-imac材料静置至其沉到离心管底部，弃上清。
3、加入适量 0.1% tfa水溶液将 spe-ti-imac材料分散，混匀，静置至其沉到离心管底部，弃上清。
4、重复步骤 3，洗 5-6次左右，目的是尽量去除未螯合的 ti4+。
5、加入 200 mm nacl/0.1% tfa水溶液洗涤 spe-ti-imac材料 2次。
6、加入 0.1% tfa水溶液洗涤 2次，均匀转移至离心管中，可根据实验需求将 spe-ti-imac材料分散成不同的浓度(如 100 mg/ml或 10 mg/ml)，于 4℃保存。
7、检测 spe-ti-imac材料是否成功螯合 ti4+：取 100 μl次洗涤的上清液，加入100 μl 30% h2o2(市售双氧水原液)中，若溶液不变色，说明螯合后的 spe-ti-imac材料已经洗干净。若溶液变色，则继续洗涤。同时，可取少量 spe-ti-imac材料，加入 100 μl 30% h2o2中，若材料呈现明显黄色，说明 ti4+螯合的 spe-ti-imac材料制备成功，可用于后续磷酸肽富集。
注意：上述 3-6步骤为 spe-ti-imac材料的洗涤，主要目的是洗涤未螯合的 ti4+，请勿省略。
二、tip (spe)法富集磷酸化肽
1、蛋白酶解液与 loading buffer按体积比 1:1均匀混合，spe-ti-imac：蛋白酶解液=20:1-30:1(m/m)均匀混合。以下以 250 μg蛋白酶解液，spe-ti-imac材料：蛋白酶解液=20:1为例。
注意：loading buffer一定要足量，保证 tfa终浓度≥3%；因 spe-ti-imac材料在 ti4+螯合过程中会略有损失，建议根据实验具体情况，自行优化材料与样品的使用比例，以达到使用效果！
2、向 5 mg ti4+螯合的 spe-ti-imac tip柱中加入 200 μl 0.1%tfa，清洗材料。
3、250 μl蛋白酶解液(1 μg/μl)与 loading buffer按体积比 1:1充分混合，加入到 tip柱中进行富集，总时间控制在 20 min左右。
4、加入 200 μl wash buffer 1洗涤，除去非特异性吸附，重复 1次，总时间控制在 10 min左右。
5、加入 200 μl wash buffer 2洗涤 1次，除去上述步骤中残留的盐，时间控制在 5 min左右。
6、加入 200 μl elution buffer洗脱 2次，合并洗脱液，即富集好的磷酸肽，总时间控制在 15 min左右。
7、洗脱的样品在冻干机中冻干，于-20℃保存，质谱分析时需用 1% fa复溶。
注意：tip法富集磷酸化肽一般通过离心的方式进行，一是为了更好的控制液体从 tip中的流出速度(以上述 5 mg spe-ti-imac tip柱为例，上样和洗脱的过程离心力一般控制在 80-100 g，洗涤过程控制在 200 g)，二是可以保证条件的一致，从而保证结果的重现性。上述 2-5步骤中的时间为离心时间。