一、原理
sanger双脱氧链终止法是第一代测序技术中最为经典的一种。其巧妙的利用dna复制原理,利用ddntp来部分代替常规的dntp作为底物进行dna合成反应。在dna合成时,一旦ddntp参入到合成dna链中,由于ddntp脱氧核糖的3’-位碳原子上缺少羟基，而不能与下一位核苷酸的5’-位磷酸基之间形成3’,5’-磷酸二酯键，从而使得正在延伸的dna链在此ddntp处终止。
二、实验步骤
1. 将待测序测序的dna片段进行pcr扩增，得到充足的dna模版用于进行测序。
得到的dna模板需要进行纯化，需要确保去除所有杂质，包括dna片段、蛋白质、rna等。
2. 根据待测序列的特点与实验要求，设计一些特定的引物。
一般来说，通用引物的长度以15～30bp为宜。
3. 合成标记物。标记物是指示测序反应是否成功的物质，通常是一种荧光染料或放射性同位素。
4. 将dna模板、引物、dna聚合酶和标记物等物质混合在一起，进行测序反应。
在反应过程中，dna聚合酶将根据dna模板中的碱基序列合成新的dna链，同时将标记物结合到新合成的dna链中。
5. 将反应产物进行电泳分离，根据标记物的不同荧光信号或放射性同位素的存在，确定dna序列中的碱基排列顺序。
在sanger测序法的基础上，将荧光信号接收器和计算机信号分析系统替代放射自显影技术，使用荧光素标记替代32p或35s单一放射性核素标记，打开了dna测序技术自动化的大门。
三、sanger测序法的优缺点
优点：
1. sanger是直接对dna分子进行测序，适用于已知序列的验证测序、文库筛选、克隆鉴定、pcr重测序等。
2. 其zui大优点在于读取速度很高、高精确度，而且成本相对很低。相较于化学降解测序法，对于富含g-c的区域也不会影响测序效果。
缺点：
1. 必须有已经序列设计测序引物，对于未知序列必须构建克隆后才能测序，难以实现基因组水平的大规模测序。
2. 测定碱基序列需要大量wan全相同的dna拷贝。
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