1、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
3、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
6、显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
10分钟.
7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。