检测rna浓度、纯度和完整性的方式主要有以下几种:
紫外分光光度计法:
测量260nm吸收值计算rna浓度,测量260nm/280nm吸收值的比值,用于评估rna纯度。需要注意的是:在检测核酸物质时应该在固定的ph溶液中进行。
260nm/280nm的比值范围在 1.9~2.1 之间。<1.9,说明有蛋白质残留;>2.1,说明rna可能发生降解。
琼脂糖凝胶电泳:
完整的rna通常有三条带,最亮的是28s条带,其次是18s条带,最淡的是5s条带(部分试剂盒提取时会过滤掉5s条带)。通过琼脂糖凝胶电泳可以检测28s和18s的比值。该方法主要用于检测rna的纯度和完整性。
如果28s和18s条带明亮、清晰、条带锐利,28s的亮度在18s条带的两倍以上,我们认为rna的质量。
若rna条带出现弥散,原因可能:rna被核酸酶降解、电压或电流过大、上样量过高或过低等。
上述两种方法在实验室比较常用,此外还有几种检测方式供大家选择。
荧光染料检测:
通过荧光染料和rna结合,荧光活性增强。此方法的灵敏度较高,主要用于检测rna的浓度。
微毛细管电泳:
可使用软件的rin(rna integrity number)分数评估,10为rna完整性最好,0为最差。此方法的灵敏度和分辨率较高,可用于检测rna浓度、纯度和完整性。
3’-5’完整性检测:
是在一个rna样本中检测gapdh mrna的完整性来代表所有rna的完整性,主要用于检测rna的完整性。
