fitc-n=c=s + n-h2-蛋白质 → fitc-ns-c-n-h2-蛋白质
常用marsshall（1958）法标记荧光抗体，也可以根据条件采用chadwick等标记法或clark等（1963）的透析标记法。
1.marsshall法
（1）材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol／l（ph9.0）碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、ph7.2或3.0的0.01mol／lpbs等。
（2）方法及步骤
①抗体的准备：取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使zui后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。
②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0.01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a.蛋白溶液：含量amg／m1；容积bml。
b.总蛋白量（axb）＝crag。
c.c／20～c／10＝dmg（如蛋白含量低于20mg／ml，用c／10；如高于20mg／ml，用c／20）。
d.荧光素fitc的量：（1／50～2／100）xc＝emg。
e.巳0.5mol／l（ph9.5）碳酸盐缓冲液d／10＝fml。
f. pbs量d-（b+f）=gml。
注：a为蛋白含量，mg／ml；b为蛋白质溶液的容积；c为蛋白总量，mg；d为常数，mg；正为荧光素的量，mg；f为碳酸盐缓冲液的容积，ml；g为pbs的容积，ml。
③结合（或标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁（大约在5—10min内加完），加完后，继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析：结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心（2500r／min）20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用ph8.0缓冲盐水透析（0～4~c）过夜。
⑤过柱：取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶sephadexg-25或g—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0.01mol／l磷酸盐缓冲液（ph7.2）；过滤量：12ml标记全球蛋白液（过滤前未透析）；收集量：20ml（稀释1.7倍左右）。
2.chadwick法
（1）试剂和材料：抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0.01mol/l ph8.0pbs、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯（25ml）搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）透析袋等。
（2）方法及步骤
①抗体准备：用o～4~c的ph8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg／ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中。
②荧光色素准备：按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0.01rug计算，称取所需的荧光素，用3％碳酸钠水溶液溶解。
③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在o～4~c冰箱中结合（最hao在磁力搅拌机上持续搅拌）18～24h。
④透析和柱层析：方法同marsshall法。
3.改良法
（1）试剂和材料
①0.01mol／l（ph7.2）pbs配法中，校定ph至7.2。naci 18g、na2hp04 1.15g，溶于2000ml蒸馏水
②0.5mol／l（ph9.0）碳酸盐缓冲液配法 取0.5mol／lnazcos（5.3％）10ml加入0.5mol／lnahc03（4.2％）90ml，混合后，校定ph至9.0。
③3％碳酸钠水溶液配法 称l 5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。
④其他试剂和材料 l％叠dan化钠、离心机及离心管、烧杯（25m1）、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500m1）透析袋等。
（2）方法及步骤
①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水（0.15mol／lnacl）及缓冲液（0.5mol／lnahc03—na2c03，ph9.0）稀释使每毫升内含蛋白质lomg，缓冲液为总量的10％，降温至4℃。
②加入异硫氰酸盐（fitc）荧光素[蛋白：荧光素＝（50—80）mg/mg]，在0～4℃。
下电磁搅拌12～14h。
③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵（用nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止）。
④将制备好的荧光抗体加叠dan化钠o.01％，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，一20~c保存可达2年以上。