atcc细胞真核双基因共表达载体phtert-ires-sv40转染bmges, 48 h后用g418抗性药物加压筛选。约3周后, 获得阳性克隆, 命名为hl-bmges, 挑取单克隆扩大培养(图3)。获得的单克隆以“铺路石”样细胞类型生长。继续扩大培养, 细胞仍以紧密单层生长方式增殖, 细胞体外持续培养达30代依然生长旺盛。
转染后阳性克隆的rt-pcr鉴定
分别从筛选出的阳性细胞hl-bmges和未转染的bmegs中提取基因组mrna, rt-pcr扩增htert 和sv40 lt, 阳性细胞基因扩增的产物长度为3.45 kb 和363 bp, 未处理组为阴性结果, 所得结果与预期的一致。
western blot鉴定phtert-ires-sv40阳性克隆
western blot检测结果表明, 第15代阳性细胞 hl-bmges中的htert和sv40 lt均能正常表达, 蛋白分子量为125 kda和94 kda。阴性细胞bmges中 htert和sv40 lt不表达。内参β-action在阳性细胞和对照均稳定表达, 蛋白分子量为43 kda。
流式细胞鉴定阳性细胞增殖能力
利用流式细胞技术进行阳性细胞周期分析。随机选取第10代hl-bmges, 对照组为未转染phtertires-sv40、正常培养的bmges第10代。通过流式atcc细胞仪数据分析表明, hl-bmges的细胞周期活动是从g0/g1期向g2期过渡, 处于s期细胞占细胞总数为27.2%, 阳性细胞中第10代细胞s期相对较高。对照组的细胞大部分处于g0期, 处于s期细胞则相比较低(对照组为10.7%)。结果表明, 阳性细胞具有较强的增殖能力。
甲基斑蝥胺 hplc法含量测定 50mg 100465-200401
呋喃唑酮 含量测定 100mg 100466-200401
吗多明 含量测定 100mg 100467-200701
替加氟 hplc法含量测定 50mg 100468-200401
尿嘧啶 hplc法含量测定 50mg 100469-200401
柠檬烯 含量测定 200mg 100470-200701
溴丙胺太林 hplc法含量测定 50mg 100471-200301
盐酸妥洛特罗 hplc法含量测定 50mg 100472-200401
盐酸环仑特罗 uv法含量测定 50mg 100473-200401
溴甲东莨菪碱 含量测定 50mg 100476-200301
无水磷酸氢二钠 含量测定 100mg 100480-200501
atcc细胞