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DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)真核蛋白操作步骤

2025/2/17 3:31:29发布27次查看
dna甲基转移酶3b(dnmt3b)真核蛋白操作步骤:
ⅰ 实体组织蛋白的提取
1. 在每1ml 冷lysis buffer加入10 μl磷酸酶抑制剂, 1 μl蛋白酶抑制剂和 5μl 100mm pmsf,混匀。冰上保存数分钟待用。
2. 每100mg固体组织置于培养皿中,剪碎成3mm×3mm左右的小块,加入0.5~1 ml冷 lysis buffer,玻璃匀浆器上下手动匀浆15次,注意低温操作;
3. 取组织匀浆液转移到1.5ml预冷的离心管,离心10000转/分,4℃离心5 min;
4. 取上清转移至新的预冷的离心管中,即为全蛋白提取物,蛋白定量(bradford法、bca法);
5. 分装保存于-70℃,避免反复冻融。
ⅱ 培养细胞蛋白提取
1. 贴壁培养的细胞,吸去培养基后,加入10ml/150mm培养板的冷pbs洗两次,每次振摇数次以尽量去除培养液;
2. 悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞,将细胞及培养液移至离心管中, 1000转/分离心10 min,再用10ml/150mm培养板的冷pbs,1000转/分离心5 min洗两次;
3. 在每 1ml冷 lysis buffer加入10μl磷酸酶抑制剂, 1μl蛋白酶抑制剂和5μl 100mm pmsf,混匀。冰上保存数分钟待用。
4. 细胞洗涤后,转至新的预冷的离心管中,加入上述配制好的冷lysis buffer,加入量如下表所示:
细胞数量
lysis buffer加入量
107个
0.5 ml~1 ml
5×106个
0.2 ml~0.5 ml
5.置于4℃摇床平台上,温和振荡15 min;
6. 14,000rpm,4℃离心15min,取上清为全蛋白提取物, 蛋白定量(bradford法、bca法);
7. 分装保存于-70℃,避免反复冻融
dna碱性胶上样液(1.5 ml)
dna碱性胶上样液(10 ml)
dna尿素-page上样液(1.5 ml)
dna尿素-page上样液(10 ml)
dna上样液(红),6×(非甘油)(见关联产品)
dna上样液(蓝),6×(非甘油)(见关联产品)
dna上样液,6×(红)
dna上样液,6×(蓝)
mirna尿素-page上样液(1.5 ml)
mirna尿素-page上样液(10 ml)
三合一rna上样液(a型)
三合一rna上样液(b型)
核酸染料
sybr green ⅱ核酸染料
超快核酸银染试剂盒
电泳级sybr green i
电泳级耐热型sybr染料
绿如蓝核酸染料(uv)(0.5 ml)
绿如蓝核酸染料(uv)(1.5 ml)
绿如蓝核酸染料(可见光型)
溴化乙锭干粉
溴化乙锭清除剂(eb清除剂)
溴化乙锭溶液(1.5 ml)
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