dapi（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）是一种荧光染料，常用于核dna 染色。它用于荧光显微镜、染色体扩散、facs 和细胞检测等成像实验【1-4】。然而，紫外光激发会导致dapi 的光转换，从而在成像系统的fitc/gfp 通道中检测dapi 荧光，从而导致结果解释错误【5，6】。dapi 还需要固定细胞以实现染色。在这个亮点中，我们展示了dapi 染色的一些替代方法，包括stainfree 技术，该技术不需要染色，并且可与活细胞一起使用。
molecular devices spectramax® i3 多功能微孔板酶标仪采用spectramax® minimax 300 成像细胞计数仪，使用stainfree 细胞检测技术来定量细胞。这种非标记方法使用透射光成像和复杂的软件来识别单个细胞或细胞群。用户可以“教导”软件通过监督机器学习算法来识别细胞。这使得科学家能够对细胞进行计数并监测细胞生长，而不会在昂贵的染色程序中损害细胞或损失时间和金钱。
dapi 的另一种替代方法是molecular devices earlytox 活细胞红色染料。这种细胞渗透性红色荧光染料可对培养物中所有细胞的核dna 进行染色，无论其活性如何，并可在需要核染色的成像检测中用作dapi 的替代物。在622 nm 激发和645 nm 峰值发射的情况下，活的红色染料在成像检测中不会干扰fitc 通道。
我们进行了一项细胞计数实验，以证明stainfree 技术和活细胞红色染料方法与dapi 染色相比的性能。dapi 的两种替代方案均为用户提供了对活细胞进行计数的优势，而无需耗时的固定步骤。stainfree 技术使用户不受染色程序的限制，并使他们能够使用细胞进行额外的下游分析。
优势
• 使用stainfree 技术实现活细胞计数，同时无需染色前的固定步骤，避免昂贵
的染色程序
，节省时间和金钱
方法
cho-k1 细胞以20，000 至300 个细胞/孔的密度接种到96 孔板中，连续进行两倍稀释，并在37°c 下附着并生长过夜。孵育后，在37°c 下用含4% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水（pbs）固定孔的子集30 分钟。固定后，用1x pbs 洗涤细胞两次，然后在0.1% triton x-100 中孵育5 分钟。用pbs 洗涤细胞两次，并用pbs 中的2.9 µm dapi 染色30 分钟。染色后，用pbs 洗涤细胞三次。
剩余的活细胞，并用活红色染料染色。将染料储备溶液在pbs 中以1：2000 的比例稀释并添加到细胞中。孵育30 分钟后，使用minimax 细胞仪上的透射光和红色荧光（cy5）通道对活细胞进行成像。使用softmax pro 软件进行stainfree 分析和核计数。图1 显示了使用stainfree 或live red dye 节省的时间。
为了进行比较，在imagexpress® micro xls 宽场高内涵分析系统中使用cy5 和dapi 通道对活（红色染色）和固定（dapi 染色）细胞进行成像。按顺序为比较两个成像系统的细胞计数，将目标区域（roi）应用于使用
minimax 细胞计数器采集的图像，以匹配imagexpress micro xls 系统上成像的区域。使用softmax pro 软件创建图形。
图1：使用stainfree 技术与活红色染料与dapi。与使用dapi 进行固定和染色相比，stainfree 工作流程可节省约70 分钟的时间。此外，使用stainfree 技术分析的细胞仍然存活，并可用于其他检测。
结果
用活红色染料染色并在minimax 细胞计数器的红色荧光和透射光通道上成像的细胞如图2 所示。对于红色荧光图像，使用softmax pro 软件中的预定义“nuclei”设置来准确识别染色的细胞核。对于在透射光通道中成像的细胞，使用stainfree 技术来识别细胞。软件中的预定义设置“cellsa”为这些cho 细胞实现了精确的结果。stainfree 细胞计数与荧光细胞核计数非常接近（图2，图），表明minimax 细胞计数仪和softmax pro 软件可准确消除对细胞核染色计数的需求。使用imagexpress micro xlssystem 和metaxpress® 软件对dapi 染色的细胞进行成像和计数。对于比较，使用cy5 通道在同一系统上对活的红色染料染色细胞进行
成像。染色细胞的图像如图3 所示。使用两种染料的细胞计数非常接近（图3，图）。通过此比较，我们确认使用dapi 的细胞计数与使用stainfree 技术的细胞计数相当。
图2. 使用minimax 细胞计数器对细胞进行计数。用活红色染料染色的细胞在红色荧光（左上）或透射光（中上）通道中成像。stainfree 细胞计数（右上角，紫色掩膜）与基于红色细胞核染色的细胞计数密切相关，如图所示（绿色圆圈，stainfree 计数；红色圆圈，红色细胞核计数）。两条曲线的r2值为0.99。
图3. 在imagexpress xls 系统中计数的细胞。对用活红色染料（左上）或dapi（右上）染色的细胞进行成像，并通过在softmax pro 软件（下图）中绘制图表来证明使用两种染料获得的计数的密切相关性。对于两条曲线，r2均为0.99。
结论
stain free 技术和live red dye 在细胞计数方面与dapi 一样有效，dapi 需要在染色前进行固定。stainfree 细胞计数是最大限度地提高细胞活性和减少细胞处理时间的好选择，因为它既不需要荧光染料，也不需要固定。对于需要细胞核染料的情况，例如，为了监测细胞核大小或染色水平，可以使用活的红色染料代替dapi，但不需要固定。它也不会干扰绿色荧光成像，因为dapi 已被证明是如此。使用stainfree 技术或live reddye 可实现活细胞检测的更多多功能性。