1、 rna模板质量差，需要重新制备 rna模板，可通过琼脂糖凝胶电泳检测质量。
2、逆转录后的cdna中含有高浓度的模板 rna和逆转录试剂成分，可能会对后续的pcr产生抑制作用，所以可以适当梯度提高 cdna稀释比例（通常来说可将 cdna 原液稀释5-10倍，其最佳模板加入量以扩增得到的 ct 值在20-30个循环为好）。
3、起始的 rna模板量低，需要减少稀释倍数或增加 rna模板量。
4、基因本身原因（复杂和长度），可以重新设计复杂基因的引物，避免复杂结构。或者用三步法程序或延长两步法程序的延伸时间。
5、 逆转录或者定量产品性能差，可以通过做平行不用品牌产品对比实验，对比逆转录产品性能。