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PCR反应液的污染消除方法

2025/1/12 7:01:11发布15次查看
pcr是非常灵敏的一项检测,100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增,从而容易出现dna污染导致的假阳性。首先,要辨别pcr污染的来源。设立阴阳性对照,有利于检测反应体系各成分的污染情况。尤其是设立空白对照,即包括pcr的全部组分,而不加模板dna,这对检测试剂中pcr产物残留污染是非常有益的。
在排除试剂污染的可能性外,更换试剂后,若不久又发现试剂被污染了,则考虑可能为环境污染。环境污染的最主要原因是dna溶液的溅出和dna气溶胶造成的实验区域的污染,这尤其在pcr产物扩增区容易出现。移液器枪头和ep管架是也较常见的污染部位。
如果是环境污染,还可对每个区域进行涂抹采样和核酸提取,以最终鉴定污染的区域所在。
对于pcr反应液的污染,可采取以下方法:
1、dnase i法:
pcr混合液(未加模板和taq聚合酶)加入0.5u dnase i,室温反应30min后加热灭活,然后加入模板和taq聚合酶进行正常pcr扩增。
2.、内切酶法:
选择识别4个碱基的内切酶(如mspi和taqi等),可同时选择几种,以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷,室温作用1h后加热灭活进行pcr。
3、紫外照射法:
未加模板和taq聚合酶的pcr混合液进行紫外照射,注意事项与方法同上述uv照射法。
4、尿嘧ding糖苷酶(ung)法:
用dutp代替dttp,使pcr产物中掺入大量du。在再次进行pcr扩增前,用ung处理pcr混合液即可消除pcr产物的残留污染。由于ung在pcr循环中的变性一步便可被灭活,因此不会影响含du的新的pcr产物。
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