一、微生物法
1.原理
一种微生物生长必需某一些维生素，lactobacillusarabinosus的生长需要尼克酸。尼克酸是指具有尼克酸生物学活性的吡啶3-羧酸及其衍生物的总称。它是白色晶体，是维生素中*稳定的一种，对酸、碱、热、光及弱氧化剂都很稳定，微溶于冷水，易溶于热水及乙醇。其检出限为10ng。
2.适用范围
本方法来源自aoac和国标gb12395-90。适用于食物及饲料中的尼克酸的检测。
3.仪器
（1） 电热恒温培养箱(37±0.5℃)
（2） 无菌室（紫外灯**）
（3） 电热手提式压力蒸汽**器（121℃，高压30min）
（4） 液体快速混合器
（5） 离心机（3000转，10min）
（6） 碱式滴定管
（7） 硬质玻璃试管
4.试剂
所用试剂皆为分析纯；所用水皆为蒸馏水
4.1 标准溶液的配制
（1）尼克酸标准储备液（0.1mg/ml）：准确称取50.0mg已干燥恒重并储于五氧化二磷干燥器中的尼克酸标准，以25%乙醇溶液溶解并定容至500ml，于冰箱中保存。
（2）尼克酸标准中间液（1ug/m）：吸取1.00ml尼克酸标准储备液，置于100ml容量瓶中，用25%乙醇溶液定容，混匀，于冰箱中保存。
（3） 尼克酸标准工作液（0.1ug/m）：临用时吸取5.00ml尼克酸标准中间液，置于50ml容量瓶中，用水定容，混匀。
4.2 其它试剂的配制
（1） 0.5mol/l硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28ml h2so4，用水稀释至1000ml。
（2） 10mol/l氢氧化钠：溶200g naoh于水中，稀释至500ml。
（3） 0.1mol/l氢氧化钠：，取10ml 10mol/l naoh，用水稀释至1000ml。
（4） 0.04%溴甲酚绿溶液，称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4ml0.1mol/lnaoh研磨，加少许水继续研磨，直至*溶解，用水稀释到250ml。
（5）酪蛋白（sigma公司）：称取50g不含维生素的酪蛋白，加200ml（3mol/l）盐酸，121℃磅压力下水解6小时，将水解物转移至蒸发皿内，在水浴上蒸发至膏状。加200ml水使之溶解后再蒸发至膏状，反复3次，以除去盐酸。
注意：*酸解酪蛋白是为了去除酪蛋白中的维生素，确保培养基中不含代测的尼克酸，但酸解并不一定*，因此选用不含维生素的酪蛋白。
*水浴蒸发时不可蒸干或使之焦糊，若溶液被蒸干，水解液所含营养物已被破坏
用10mol/l氢氧化钠调节ph值至3.5，以溴酚蓝作外指示剂。加20g活性炭，振摇，过滤，反复操作至滤液无色。滤液加水稀释至500ml，加少许甲苯置冰箱中保存。
*注意：活性炭不能在溶液中太久，否则容易破坏酪蛋白的营养成分
（6） 溴酚蓝：称取0.1g溴酚蓝，用1+4乙醇溶解后，再加乙醇稀释至100ml。
（7） 甲苯
（8） 4mol/l盐酸溶液，v+v=1+4
（9） 5mol/l生理盐水：取9gnacl溶于1000ml水中。
（10）*、*溶液：称取4gl-*和1gl-*溶于800ml水中，加热至70～80℃，逐滴加入20%盐酸，不断搅拌，直至*溶解为止。冷至室温，加水稀释至1000ml。加少许甲苯于冰箱中保存。
（11）腺嘌呤、*、*溶液：称取硫酸腺嘌呤，盐酸*及*各0.1g，加75ml水和2ml浓盐酸，然后加热使其*溶解，冷却，若有沉淀产生，加浓盐酸数滴，再加热。如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止。用水稀释至100ml。加少许甲苯于冰箱中保存。
（12）d-*、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇溶液：称取d-*、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇各10mg于烧杯中，以水溶解并稀释至1000ml，将此液置于棕色瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存。
*注意：此溶液见光分解，因此储存于棕色瓶中
（13） 0.02mol/l醋酸溶液：取1.18ml纯的冰醋酸，稀释至1000ml
（14）核黄素、盐酸硫胺素、*溶液：溶解1mg*结晶于100ml0.01747mol/l的醋酸中，取此液4ml（相当于40ug*），加入20mg核黄素和10mg盐酸硫胺素，以0.01747mol/l醋酸溶解并稀释至1000ml，将此液置于棕色瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存。
*注意：此溶液见光分解，因此储存于棕色瓶中
（15） 甲盐溶液：取25g磷加水溶解后稀释至500ml，加少许甲苯于冰箱中保存。
（16）乙盐溶液：取10g*、0.5g氯化钠、0.5g*和0.5g硫酸锰，加水溶解后稀释至500ml，加5滴浓盐酸，加少许甲苯于冰箱中保存。
（17） 乙醇溶液 v/v=1/3
（18） 溴酚蓝：称取0.1g溴酚蓝，用1+3乙醇溶液溶解后，再稀释至100ml。
（19）0.04%溴*蓝溶液：称取0.1g溴*蓝于研钵中，加1.6ml，0.1mol/lnaoh，研磨，加少许水继续研磨，直至*溶解，用水稀释至250ml。
（20） 0.004%溴*蓝溶液：量取100ml0.04%溴*蓝溶液，加水稀释至1000ml，供滴定用。
（21） 基本培养基储备液：
酸解酪蛋白 50ml
*、*溶液 50ml
腺嘌呤、*、*溶液 10ml
d-*、对氨基苯甲酸、吡哆醇溶液 10ml
核黄素、盐酸硫胺素、*溶液 10ml
甲盐溶液 10ml
乙盐溶液 10ml
* 10g
无水醋酸钠 10g
（或结晶醋酸钠naac.3h2o 16.6g）
将上列试剂混合，用水稀释至500ml用氢氧化钠调ph至6.8，以溴*蓝作外指示剂。
（22） 琼脂培养基：
* 1g
醋酸钠 1g
蛋白胨 0.8g
酵母提取物干粉 0.2g
甲盐溶液 0.2ml
乙盐溶液 0.2ml
琼脂 1.2g
混合，加水至100ml，加热至琼脂*溶化，以溴*蓝为外指示剂，用盐酸趁热调ph至6.8，尽快倒入试管中，每管3～5ml，加塞棉塞，于压力蒸汽**器中121℃**10min，取出后竖直试管，冷至室温后保存于冰箱中。
4.3菌种的制备与保存
（1） 菌种的制备与保存：以阿拉伯乳酸杆菌�lactobacillus arabinosus 17-5 atcc no.8014简称lact.a?纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在37±0.5℃恒温箱中保温16-24小时，取出于冰箱中保存，至多不超过两周。保存数周以上的菌种，不能立即用作制备接种液之用，一定要在使用前每天转种一次，连续2-3天，方可使用，否则生长不好。
（2） 种子培养液的制备：加5ml0.1ug/ml的尼克酸标准应用液于尖头试管中，加入5ml基本培养基，塞好棉塞，于压力蒸汽**器内（高压锅）121℃下**10min，取出，置于冰箱中，此管可保存数周之久。
5.操作步骤
5.1样品制备：取含尼克酸约5-50ug的均匀样品于100ml三角瓶中，加0.5mol/lh2so450ml。放入高压蒸汽锅121℃下水解30min，取出，于水中冷却，用10mol/lnaoh和0.5mol/lh2so4调ph值至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，滤纸过滤，保存滤液于冰箱内备测（保存期不超过36小时）。
*用0.5mol/l硫酸水解，可以断开尼克酸和其它物质结合的键，使尼克酸游离出来。
*观察溴甲酚绿至草绿色为终点，说明溶液ph值到了4.5.调ph值至4.5可以除去样品中刺激和抑制**生长的物质，如：淀粉、脂肪酸及磷脂。许多蛋白质的等电点也在ph4.5，所以此ph值也可用来沉淀蛋白质。
5.2接种液的制备：使用前**，将阿拉伯乳酸杆菌菌种由储备菌种管移种于已**的种子培养液中，可同时制备两管，在37±0.5℃的恒温箱中培养16-24小时。取出离心10分钟（3000rpm）倾去上部液体，用已**的生理盐水淋洗2次，再加10ml**过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已**的注射器内，立即使用。
5.3样品标准曲线的测定：3组试管各加0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0ml工作液，每管加水稀释至5ml，再加5ml基本培养基，混匀，加棉塞。
5.4试样的测定：在试管中分别加入1，2，3，4ml样液，加水稀释至5ml，再加入5ml基本培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅（121℃）高压10min，冷至室温备用。
5.5接种和培养：每管种一滴接种液，于37±0.5℃恒温箱中培养72小时
*注意：接种后用振荡器振荡混匀试管中的液体。
5.6滴定：从恒温箱中取出后，将试管中培养液倒入50ml三角瓶中，用5ml0.004%溴*蓝分二次淋洗试管，洗液倒入该三角瓶中，以0.1mol/l氢氧化钠溶液滴定，呈绿色即为终点，此时ph约6.8，绘制尼克酸标准工作曲线，用测定管得到的值，在标准曲线上查到测定管内所含尼克酸的量。
* 水解液的ph值调至6.8是为了不同的试剂加入基本培养基时，不致改变基本培养基的ph值。（此乳酸菌生长的适宜ph值为6.8）
6.计算
以尼克酸标准系列的不同微克数为横坐标，滴定所需0.1mol/l氢氧化钠 毫升数为纵坐标，作为标准曲线。
x=（c×v/m）×f×（100/1000）
x--样品中尼克酸的含量，mg/100g；
c--每毫升样品中尼克酸含量的平均值，ug/ml；
v--样品水解液定容总体积，ml；
f--样品试液的稀释倍数；
m--试样质量，g；
100/1000--折算成每100g样品中尼克酸含量，mg。
7.举例
取一螺旋藻样品1.004g（m），处理后定容为100ml（v），从中取1ml稀释至25ml（f），取1，2，3，4ml入试管中，加入水和培养基，高压**，培养，滴定，测量根据曲线分别得出四管c值为0.037，0.073，0.110，0.136，所以四管平均值为c=（0.037+0.073/2+0.110/3+0.136/4）/4=0.036。代入方程式为：
x=（c×v/m）×f×（100/1000）=（0.036×100/1.004）×25×（100/1000）=8.96（mg/100g）
因此得出每100克螺旋藻中含8.96毫克尼克酸。
8.注意事项
（1） 当管中尼克酸的量少于0.05或多于0.3ug，即超过标准曲线范围时所得到的数值不能用于计算。
（2） 3mol/l盐酸的配制方法：取250ml浓盐酸，加入750ml蒸馏水，共配成1l 3mol/l的盐酸
（3）试管应先用洗衣粉清洗后，用水冲净，再放入酸缸中浸泡1天左右，捞出后再用自来水和蒸馏水清洗干净，凉干，方可再用。二、比色法
1.原理
*和*于ph=4.5下用稀nh4oh提取，再与cnbr溶液与10％对氨基苯磺酸反应，测其比色值。
2.适用范围
选自aoac；适用范围：适用于**、食物和饲料
3.仪器设备
（1） 容量瓶，100ml
（2） 锥形瓶，250ml
（3） 电热板
（4） 高压釜（121℃，30min）
（5） 离心管，5ml
（6） 漏斗
（7） 通风橱
（8） 酸式滴定管
比色计（**430-450nm，谷物470nm）
4.试剂
所用试剂皆为分析纯；所用水皆为蒸馏水
4.1尼克酸标准溶液
（1） 尼克酸标准储备液（100μg/ml）：将50mgusp烟道参比标准（贮于p2o5干燥器中，放于暗处保存。）
（2） 标准中间液ι（10μg/ml）：取少量贮备液放置至室温。用蒸馏水将10.0ml贮备液稀释至100ml。
（3） 标准工作液π（4μg/ml）：将恢复至室温的贮备液2.0ml用蒸馏水稀释至50ml。
4.2其它试剂
（1） 稀氢氧化铵溶液：5mlnh4oh用h2o稀释至250ml
（2） *：v+v=1+5
（3） 磷酸缓冲液（ph＝8）：将60gna2hpo4·7h2o和10gkh2po4溶于蒸馏水中并稀释至200ml。
（4）溴化氢溶液（10%，通风橱中制备）：将370mlh2o温热至40℃，并加入40gcnbr。振荡至溶解冷却并稀释至400ml。溶液在冰箱保存。
*cnbr剧毒，切勿与皮肤接触，必须在通风橱中操作。
（5）10%对氨基苯磺酸溶液：按每次1ml将nh4oh加到20g对氨基苯磺酸和170ml蒸馏水的混合液中，直至酸溶解为止。用盐酸与蒸馏水溶液（1：1）调节ph至4.5，采用溴甲酚绿指示剂指示。稀释至200ml。
*注：因为溶液有颜色会影响*后结果，所以稀释结束后溶液应几乎无色
（6）55%对氯基苯磺酸溶液：在55g对氨基苯磺酸中加入27ml蒸馏水和27mlnh4oh，振摇至溶解。（必要时加温）。用nh4oh或5nhcl调ph为7，再用蒸馏水稀释至100ml。（保存在暗处）
5.操作步骤
5.1样品制备
（1）**：将药品研碎，溶于蒸馏水中，稀释定容。取10ml样品于锥形瓶中，加入10mlhcl，在电热板上加热蒸发至约2ml，冷却，加入25-50ml蒸馏水，用40%naoh或koh溶液调节ph值至2.5-4.5。过滤，弃去10ml处液，转移至容量瓶中定容，使溶液含尼克酸约4μg/ml。
*注：溶液的尼克酸含量应在50-200μg/ml
（2）非谷类食品及饲料：称取约28g样品，加入0.5mol/lh2so4200ml，混匀，在高压釜中121℃加热半个小时。冷却，用10mol/lnaoh调节ph值至4.5，以溴甲酚绿作外指示剂，用蒸馏水稀释至250ml，过滤。取17g（nh4）2so4于50ml容量瓶中，吸取40ml样品液，用h2o稀释定容，强力振摇。过滤，混匀，取1ml作比色测定用。如果样品中尼克酸含量为16mg/1b。*终液浓度3.2μg/ml。
移取40ml标准工作液π至盛有17g （nh4）2so4的50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，此液含尼克酸3.2μg/ml。
*注：加入h2so4主要是为了去除样品中的蛋白及其它杂质，以防其对测量结果造成影响
（3）谷类产品：随同样品做1试剂空白和5个浓度的工作标准液。
分别将1.5gca（oh）2放入7个锥形瓶中，移入0、5、10、15、20、25ml标准中间液ι和2.5g样品（含100μg*），加入蒸馏水至90ml，振摇混匀。高压121℃下2小时。趁热混匀，冷却至40℃，转移至100ml容量瓶中，稀释定容。
从容量瓶移50ml上清液至离心管中，冰浴15min或置于冰箱中≥2小时。离心15min，吸取20ml上清液至盛有8g（nh4）2so4和2ml磷酸盐缓冲液的离心管中。振荡溶解并温热至55-60℃。离心5min，过滤。
5.2操作程序
（1）**制剂和非谷类食物和饲料：假如10%的对氨基苯磺酸溶液，cnbr溶液，在通风橱中用酸式滴定管滴入，用标准工作液π，如下表制备各管：试剂标准空白 样品空白
标准溶液（ml） 1.0 1.0
h2o（ml） 5.0 5.0
稀nh4oh（ml） 0.5 0.5
10%对氨基苯磺酸 2.0 2.0
稀hcl（ml） 0.5 0.5
样品溶液
标准溶液（ml） 1.0 1.0
稀nh4oh（ml） 0.5 0.5
cnbr（ml） 5.0 5.0
10%对氨基苯磺酸（ml） 2.0 2.0
h2o（ml） 0.5 0.5*注：cnbr有毒，注意通风
每只样品都要分别制备样品空白。
将标准和样品移入试管中，分别加入5ml蒸馏水作为标准空白和样品空白。转动试管内的液体，立即加入稀nh4oh，转动，加对氨基苯磺酸，再次旋转混合。立即加入0.5ml稀hcl，混匀，置于光电比色计上，加入对氨基苯磺酸后约30s内在430和450nm波长之间任意波长调节仪器至0的a值。从加入稀nh4oh开始按标准空白同样的方法处理标准溶液。立即转动管子，加cnbr溶液并再次转动混匀，在加入cnbr溶液后30s后转动管子，加入对氨基苯磺酸溶液，再转动。立即加入0.5ml蒸馏水，混匀，加塞。，测量。（加入对氨基苯磺酸溶液后1.5min时颜色*深，保留2min，然后慢慢褪色。）
将样品空白设在0a，测样品溶液的a值。若标准和样品液含量大致相等，则尼克酸含量与a值成正比。
（2）谷类制品：取5只试管，其中两只加入5ml标准液，两只加入5ml样品液，另一只加入5ml蒸馏水做试剂空白。于一只空白管，一只标准管和一只样品管各加10ml蒸馏水，将所有管置于冰中冰浴30min。对剩下的管按顺序加入10ml冷的cnbr，30s后加入1.0ml55%对氨基苯磺酸溶液。
用标准空白在470nm处，调比色计为0a，加入对氨基苯磺酸后12-15min读出其它各管的a值。
*放入比色计前，试管必需冷却一致，每管必需拭干。如管呈雾状，浸于热水中片刻，测定前拭干。
6.计算
将扣除试剂空白的标准a对尼克酸含量μg/ml作图，画出适宜的直线，从此图上求出已扣除样品空白和试剂空白后样品校正的a所对应的浓度c。
mg尼克酸/g样品=c/10ng样品
7. 注意事项
（1） cnbr溶液有毒，要注意安全。
（2） 样品不同，处理方法不同，不要混淆。
（3） 注意通风橱的通风。
（4） 因为采用比色法测量，因此样品含有色素易干扰测定，影响测定结果的正确性。
（5）试管应先用洗衣粉清洗后，用水冲净，再放入酸缸中浸泡1天左右，捞出后再用自来水和蒸馏水清洗干净，凉干，方可再用。
三、*制剂中的*测定----分光光度法
1.原理
在ph约4.5处将*抽提到kh2po4溶液中，再与cnbr和巴比士酸反应。用分光光度法测定反应产物。*含量超过*三倍量时干扰*测定。
2.适用范围
选自aoac；适用于*制剂检测
3.仪器
（1） 搅拌器
（2） 量筒
（3） 锥形瓶
（4） 高压釜（121℃，15min）
分光光度计（550nm）
4.试剂
所用试剂皆为分析纯；所用水皆为蒸馏酰胺标准溶液：
（1） 标准储备液（250μg/ml）：50mgusp*标准加60%乙醇溶解并稀释到200ml。在10℃贮存。
（2）标准工作液（5μg/ml）：将少量贮备液温热至室温。取出2ml用0.3%kh2po4溶液稀释至100ml。4.2其它试剂
（1）溴化氰溶液：10%，将370mlh2o温热至40℃，并加入40gcnbr。振荡至溶解冷却并稀释至400ml。溶液在冰箱保存。使用前需恢复到室温。
*注：cnbr剧毒，切勿与皮肤接触，注意在通风橱 中操作。
（2） 溶液：
a. 13%的溶液：将30gkh2po4用蒸馏水溶解并稀释到1l。
b. 3%的溶液：将3%的溶液用蒸馏水稀释（1+9）。
（3）巴比土酸缓冲液：按每批测定需用量计算，按每100ml3%kh2po4溶液加2g试剂级巴比土酸制备。搅拌1小时，用前过滤。
5.操作步骤
5.1样品制备：取适量样品于锥形瓶中，加入0.3%的kh2po4（kh2po4的量至少是估计的*量的两倍）。若样品不易溶解，则振摇使其分散并用高压釜在121℃下加热15min。用0.3%kh2po4溶液稀释至5μg/ml。过滤。
用蒸馏水代替cnbr分别制备各样品的空白。
将1ml工作标准液或测定液置于分光光度计比色管中。加0.5mlcnbr溶液，混匀，塞住，放置25-30min，加10ml巴比土酸溶液并旋摇
*注：若30min后不能加巴比土酸溶液。将管置于碎冰浴中稳定cnbr反应。
5.2用蒸馏水代替cnbr做为适当的空白，（550nm，分光光度计设定在0a）颜色*深时测定反应产物的吸光度
*注：加入巴比土酸后2-4min时颜色*深，稳定约1min，慢慢褪去
*注：测定样品时，其放置时间不应超过30min。加入cnbr时应有规律的间隔1-2min。
6.计算
样品中*含量（mg）=（a×5×稀释倍数）/（a'×1000）
式中
a- 样品吸光度
a'--标准吸光度
5-μg*/ml标准工作液
（结果用*mg/片报告）
7.注意事项
（1） cnbr有毒，应在通风橱中操作。
（2） 样品中*含量超过*含量的三倍量时会干扰*的测定，因此样品应有明确的*和*的含量。
（3）试管应先用洗衣粉清洗后，用水冲净，再放入酸缸中浸泡1天左右，捞出后再用自来水和蒸馏水清洗干净，凉干，方可再用。
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