①．从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
②．设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl；
③．样本孔先加待测样本10μl，再加样本稀释液40μl；空白孔不加。
④．除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（hrp）标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
⑤．弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次 （也可用洗板机洗板）。
⑥．每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。
⑦．每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的od值。
结果判断
绘制标准曲线：在excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应od值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。