在应用细胞和组织培养物来进行病毒繁殖或其他培养时，未经灭菌的房间空气通过工作台面是不符合要求的。ⅱ级生物安全柜在设计上不但能提供个体防护，而且能保护工作台面的物品不受房间空气的污染。*有四种不同的类型（分别为a1、a2、b1 和b2 型），它们不同于ⅰ级生物安全柜之处为，只让经hepa过滤的（无菌的）空气流过工作台面。*可用于操作危险度2 级和3 级的感染性物质。在使用正压*的条件下，ⅱ级生物安全柜也可用于操作危险度4级的感染性物质。
a：前开口；b：窗口；c：排风hepa 过滤器；d：后面的压力排风系统；e：供风hepa 过滤器；f：风机
ⅱ 级a1 型生物安全柜
ⅱ 级 a1 型生物安全柜如上图所示。内置风机将房间空气（供给空气）经前面的开口引入安全柜内并进入前面的进风格栅。在正面开口处的空气流入速度至少应该达0.38 m/s。然后，供气先通过供风hepa 过滤器，再向下流动通过工作台面。空气在向下流动到距工作台面大约6～18cm处分开，其中的一半会通过前面的排风格栅，而另一半则通过后面的排风格栅排出。所有在工作台面形成的气溶胶立刻被这样向下的气流带走，并经两组排风格栅排出，从而为实验对象提供的保护。气流接着通过后面的压力通风系统到达位于安全柜顶部、介于供风和排风过滤器之间的空间。由于过滤器大小不同，大约70%的空气将经过供风hepa过滤器重新返回到生物安全柜内的操作区域，而剩余的30%则经过排风过滤器进入房间内或被排到外面。
ⅱ级a1型生物安全柜排出的空气可以重新排入房间里，也可以通过连接到通风管道上的套管或通过建筑物的排风系统排到建筑物外面。
安全柜所排出的经过加热和∕或冷却的空气重新排入房间内使用时，与直接排到外面环境相比具有降低能源消耗的优点。有些生物安全柜通过与排风系统的通风管道连接，还可以进行挥发性放射性核素以及挥发性有毒化学品的操作。
a：前开口；b：窗口；c：排风hepa 过滤器；d：供风hepa 过滤器；
e：负压压力排风系统；f：风机；g：送风hepa 过滤器。安全柜需要有与建筑物排风系统相连接的排风接口。
外排风式ⅱ级a2 型以及ⅱ级b1 型和ⅱ级b2 型生物安全柜
外排风式ⅱ级a2 型以及ⅱ级b1型和ⅱ级b2 型生物安全柜都是由ⅱ级a1 型生物安全柜变化而来，这些不同类型的*，连同ⅰ级和ⅲ级生物安全柜的特点见下面的表格。
生物安全柜设计上的每一种变化可以使不同的类型适用于特定的目的。这些生物安全柜相互间都有一定的差异，包括从前面的开口吸入空气的速度、在工作台面上再循环空气的量以及从安全柜中排出空气的量、安全柜的排风系统（是通过专门的排风系统还是通过建筑物的排风系统？是排到房间内还是排到建筑物的外面？）以及压力设置（安全柜是负压状态下的生物学污染管道和压力通风系统，还是由负压管道和压力通风系统所包围的生物学污染管道和压力通风系统？）
表ⅰ级、ⅱ级以及ⅲ 级生物安全柜之间的差异
生物安全柜
正面气流速度
气流百分数（%）
排风系统
（m/s）
重新循环部分
排出部分
ⅰ级a
0.36
0
100
硬管
ⅱ级a1型
0.38～0.51
70
30
排到房间或套管连接处
外排风式ⅱ级a2型a
0.51
70
30
排到房间或套管连接处
ⅱ级b1型a
0.51
30
70
硬管
ⅱ级b2型a
0.51
0
100
硬管
ⅲ级a
na
0
100
硬管
na：不适用。
a：所有生物学污染的管道均为负压状态，或由负压的管道和压力通风系统围绕。