表格一：实验仪器
仪器名称
型号
生产厂家
低温高速离心机
64r
beckman
pcr 仪
9700
abi
荧光定量 pcr 仪
7500
abi
仪器
厂家
型号
小型垂直电泳槽
biorad
164-8001
转印槽
biorad
trans-blot
脱色摇床
常州澳华
ty-80b
电泳仪
上海天能
eps-200
低温高速离心机
64r
beckman
酶标仪
thermo
thermo scientific microplate reader
表格二：试剂
试剂名称
厂家
pbs (0.01m, ph 7.4)
自配
trizol
life technologies
lv仿
国药集团
异丙醇
国药集团
乙醇
国药集团
primescript® rt reagent kit
takara
荧光定量试剂盒
takara
二、 实验步骤
1、样本处理
4℃ 12000rpm 离心收集细胞，弃上清。pbs 清洗 1 遍后，加入 1ml trizol 充分混匀。
2、两相分离 每个样品中加入 0.2 ml 的lv仿，盖紧管盖，剧烈振荡管体，室温静置 5min。4℃下 12000rpm
离心 15 min。离心后混合液体将分为下层的红色酚lv仿相，中间层和上层的无色的水相。rna 全部被分配于水相中。水相的体积大约是匀浆时加入的 trizol 试剂的 60%。
3、rna 沉淀 将水相转移到新离心管中。加入等体积的异丙醇，水相与异丙醇混合以沉淀其中的 rna。混匀并在室温孵育 10 min 后，4℃ 12000rpm 离心 10 min。
4、rna 清洗 移去上清液，加入 1 ml 75%乙醇，清洗 rna 沉淀。振荡后，4℃ 7500 rpm 离心5 min。
5、重新溶解 rna 沉淀
去除乙醇溶液，空气中干燥 rna 沉淀 5-10 min。溶解 rna 时，先加入无 rna 酶的水用枪反
复吹打几次，然后 55 到 60℃孵育 10 min。获得的 rna 溶液保存于- 70℃。
6、反转录
1) 按下列组份配制 rt 反应液
5×primescript buffer
5 μl
primescript® rt enzyme mix i
1 μl
oligo dt primer(50 μm)×1
1 μl
random 6 mers(100 μm)×1
1.5 μl
total rna
1 ng
rnase free ddh2o
up to 25 μl
2）反转录反应条件如下: 37℃ 15min，85℃ 5s。
3）反应结束后，将其放在冰上待用或-20℃保存。
7、荧光定量 pcr
引物设计
gene
forward primer
reverse primer
β-action
5′-ttccagccctccttcctg-3′
5′-gcccgactcgtcatactcc-3′
bcl
5′ -ctaccgtcgtgacttcgc -3
3′-cctattgcctccgaccct-5′
按下列组份配制 realtime pcr 反应体系
sybr premix ex taq
10 μl
pcr forward primer(10μm)
1 μl
pcr reverse primer(10μm)
1 μl
cdna 模板
1 μl
ddh2o
7 μl
total
up to 20 μl
用漩涡振荡器将管中溶液*混合均匀，短暂低速离心。
3）点样。将混合好的液体加入孔板中，每个样本的每个基因保证3个复孔,点完样之后将 pcr 板置于离心机中 2000rpm、2min，然后用锡箔纸将板包好，置于 4 度冰箱中备用。 4） pcr 反应
real time pcr 仪使用 abi7500,pcr 程序已优化 将步骤 3 中已点好样的 pcr 板置于 realtime pcr 仪上进行 pcr 反应：首先是预变形：95℃/10min
第二步是循环反应 40 cycles : 95℃/15s; 60℃/45s(收集荧光) ;72℃/45s 第三步溶解曲线：95℃/15s; 60℃/1min ;95℃/15s
三、 结果与计算（采用 2 - △△ct 法进行分析）
基因相对表达量
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