克隆是英文“clone”或“cloning”的音译，而英文“clone”则起源于希腊文“klone”，原意是指以幼苗或嫩枝插条。1963年j.b.s.haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆（clone）”的术语，把“克隆技术”带到了人们的视野中。
克隆技术又称为“生物放大技术”，目前应用泛的技术为“分子克隆”，又称重组dna技术，即通过重组技术将目的dna片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生新的遗传性状的技术。
随着分子生物学研究的不断深入，分子克隆技术也随之更新迭代，从传统的依赖限制性内切酶的方法发展到如今的ta克隆、topo克隆、无缝克隆、gateway技术等等，新的技术不断涌现，为分子生物学的发展和进化提供新的力量。今天小翌就带领大家认识一下不同的分子克隆方法。
01传统分子克隆技术传统分子克隆技术的依赖于限制性内切酶和酶切位点。主要步骤是通过限制性内切酶（翌圣的funicut™快速限制性内切酶cat#15001es-15051es）酶切载体和目的基因，通过连接酶（翌圣t4 dna连接酶cat#10300）将酶切的片段拼接在一起（即连接过程），形成可以表达目的基因的新载体（即重组质粒），使用转化技术转化至感受态细胞中，进而实现目的基因的扩增、转录和翻译。
传统分子克隆实验流程如下图：
图1.传统分子克隆实验流程
该技术最早由cohen group在1973年实现，他们将e.coli的tetr质粒psclol和nersrr6-3质粒体外限制酶切割，连接成新的质粒，转化e.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrner，实现了细菌遗传性状的转移。传统分子克隆技术较为成熟，但是该方法受到限制性酶切位点和连接效率等方面的限制，并不能高效、准确的克隆需要的目的基因。
图2.stanley cohen和herbert boyer（第一个成功实现基因工程技术的团队）
02ta克隆ta克隆（original ta cloning kit），依赖于pcr反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在克隆片段的3’末端加上a尾（即3’-a），通过连接酶（翌圣t4 dna连接酶cat#10300）把克隆片段与一个具有3’-t突出的载体dna连接起来。主要应用于不清楚目的基因dna序列的实验，通过ta克隆重组到t-载体后，使用t-载体的上下游引物扩增片段，测序，最终确定目的基因序列。其中，聚合酶的选择尤为重要，翌圣普通pcr试剂盒（cat#10102/10103/10157）、翌圣快速pcr试剂盒（cat#10157）均具有taq dna聚合酶，扩增后的pcr产物具有3’-da突出端，可轻松克隆至t载体。
图3. ta克隆流程示意图【3】
03topo克隆topo克隆技术是通过topo载体上偶联的异构酶(topoisomerase)实现插入片段的快速克隆。其原理是利用topo载体两端通过磷酸键偶联的topo酶，在连接反应中，受插入片段的5'端羟基的攻击，磷酸键释放能量。利用该能量，插入片段5'端羟基与载体片段3'端磷酸基团连接在一起，topo异构酶从载体分子上脱落，完成连接反应。不同于传统的ta克隆，topo克隆能够在2-5 min内快速完成插入片段和载体的连接反应，操作简单，连接效率。
图4. topo克隆原理
目前市面上的产品，需根据dna片段末端的不同，选择不同的topo克隆试剂盒。而翌圣新品零背景通用型topo克隆试剂盒（cat#10906），能够兼容平末端产物或粘性末端产物，不受片段末端影响，快速克隆连接，效率高，阳性率接近100%，如图5所示。
图5.topo ta/blunt克隆试剂盒轻松连接2 kb（10 ng）平末端/粘性末端片段注：a&b：topo克隆转化平板。c&d：插入片段pcr鉴定电泳图。
04无缝克隆技术传统克隆和ta克隆两种方法费时费力，过程繁冗，为了解决限制性酶切位点的限制，科学家们研发出新的、快速、简洁、高效的克隆技术——无缝克隆，区别于传统分子克隆，的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的pcr产物两端便分别带上15-20个与载体序列同源性的碱基，依靠碱基间作用力互补配对成环，不经过酶切，pcr产物和线性化载体在同源重组酶的作用下，经过一定的时间和温度即可进行转化，完成定向克隆。
图6.同源重组原理
无缝克隆技术最早是2009年由daniel gibson和j. craig venter发展起来，广泛应用的方法包括两种gibson assembly和in-fusion cloning，原理都是通过外切酶产生黏性末端，再通过同源重组酶的连接得到重组片段，但是两种方法的外切酶不同，形成重组序列的方式也不一样。gibson assembly：包含t5 exonuclease、phusion dna polymerase和taq dna ligase三种酶，通过5’→3’ t5核酸外切酶活性，沿着5’→3’方向降解dsdna，产生3’黏性末端，通过同源臂互补配对，退火后借助phusion dna聚合酶修复片段上的缺口，taq dna连接酶催化片段形成磷酸二酯键，将所有缺口补齐，获得重组片段。
图7. gibson assembly原理图【5】
in-fusion cloning：具有3’→5’ 核酸外切酶，能够识别3’末端碱基，沿着3’→5’ 方向降解dsdna，产生5’黏性末端，同源臂互补，退火后配对，因为其不含连接酶，所以要将重组片段转化到感受态细胞内，序列中的缺口会在感受态体内补平、连接，获得重组片段。
图8. in-fusion cloning原理【6】
翌圣同源重组试剂盒利用无缝克隆技术，仅需50℃反应20 min即可转化，完成定向克隆，克隆阳性率可达95%以上。其中，翌圣一步法快速克隆试剂盒（cat#10911es）可连接单片段，该试剂盒已发文章累计if达到1000+。翌圣通用型一步法快速克隆试剂盒（cat#10922es）可连接1-6片段，最长连接片段可达23 kb，是多片段连接的。通过上述的介绍，相信大家已经初步了解了目前实验室中常用的分子克隆技术，那么还有哪些新开发的分子克隆技术呢？无缝克隆中不常见、特殊的分子克隆技术又有哪些呢？关注我们，小翌会在下一期的分子克隆技术专题中，给大家介绍新的分子克隆技术，为您的实验带来新的思路与方向，期待下一次的见面~
05相关产品列表
产品定位
产品名称
产品货号
规格
通用缓冲液，5min完成精准酶切
funicut™快速限制性内切酶
15001es-15051es
50 t
常规pcr
2×hieff®pcr master mix(with dye)
10102es03/08
1 ml/5×1 ml
常规pcr，不含染料
2×hieff®pcr master mix(no dye)
10103es03/08
1 ml/5×1 ml
快速pcr，快至1s/kb
2×hieff®ultra-rapid hotstart pcr master mix(with dye)
10157es03/08
1 ml/5×1 ml
topo克隆-兼容ta/平末端
hieff clone®universal zero topo ta/blunt cloning kit
10906es20
20 t
topo克隆-ta末端
hieff clone®zero topo-ta cloning kit 零背景topo-ta克隆试剂盒
10907es20
20 t
topo克隆-平末端
hieff clone®zero topo-blunt cloning kit
10909es20
20 t
单片段一步克隆，已发文章累计if达到1000+
hieff clone®plus one step cloning kit一步法快速克隆试剂盒
10911es20/50
20 t/50 t
1-6片段一步克隆，最快5分钟完成重组反应
hieff clone®universal one step cloning kit通用型一步法快速克隆试剂盒
10922es20/50
20 t/50 t
参考文献
1.barany f.genetic disease detection and dna amplification using cloned thermostable ligase[j].proc natl acad sci usa,1991,88(1),189-193.2.holton ta,graham mw.a simple and efficient method for direct cloning of pcr products using ddt-tailed vectors[j].nucleic acidsｒes,1991,19(5),1156.3.clark d p,pazdernik n j,mcgehee m r.cloning genes for synthetic biology-sciencedirect[j].molecular biology(third edition),2019:199-239.4.seki t,seki m,onoderaｒ,et al.cloning of cdna encoding a novel mouse dna topoisomerase iii(topo iiibeta)possessing negatively supercoiled dna relaxing activity,whose message is highly expressed in the testis[j].j biol chem,1998,273(44):28553-28556.5.gibson dg,young l,chuangｒy,et al.enzymatic assembly of dna molecules up to several hundred kilobases[j].nat methods,2009,6(5):343-345.6.张阳璞,杨淑慎.几种新型植物基因表达载体的构建方法[j].生物工程学报,2015,31(03):311-327.