细胞中的dna合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“d途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为dna分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而hat培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断dna合成的“d途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径（“s途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（hgprt）和胸腺嘧啶核苷激酶（tk）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在hat培养液中，未融合的效应b细胞和两个效应b细胞融合的“d途径”被氨基蝶呤阻断，虽“s途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（hgprt）细胞，因此自身没有“s途径”，且“d途径”又被氨基蝶呤阻断，所以在hat培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应b细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应b细胞的“s途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在hat培养液中选择性存活下来，并不断增殖。