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细胞转染的原理、操作步骤以及小技巧

2024/6/25 0:08:47发布24次查看
细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、病毒介导的转染等,理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。
一、脂质体(liposome)转染方法原理
脂质体作为体内和体外输送载体的工具,已经研究的十分广泛,中性脂质体是利用脂质膜包裹dna,借助脂质膜将dna导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体,dna并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的dna自动结合到带正电的脂质体上,形成dna-阳离子脂质体复合物,从而吸附到带负电的细胞膜表面,经过内吞被导入细胞。
优点:与其它方法相比,有较高的效率和较好的重复性,它适用于把dna转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下蕞方便的转染方法之一。
二、脂质体转染操作步骤
(1)细胞培养:取6cm细胞皿,向每孔中加入2ml含1~2×105个细胞培养液,37℃ co2培养密度至40%~60%,密度过大,转染后不利筛选细胞。
(2) 转染液制备:在ep管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)
a液:用不含血清培养基稀释1ug 质粒dna。
b液:用不含血清培养基稀释2ul脂质体。
分别将a液与b液轻弹混匀,静置5分钟。
(3)吸取b液加入至a液中,轻弹混匀。室温中置10-15分钟。
(4)转染准备:用1ml不含血清培养液漂洗两次,再加入4ml不含血清培养液。
(5)转染:把a/b复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37℃温箱置6~24小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。
(6)瞬时转染后,可在48h-72h细胞长满之后,提取细胞蛋白或者rna,验证敲减/过表达效率。
注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。
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