按50:1配置bca工作液。10ulc液(蛋白标准)+90ulpbs液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。再分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中,在其他样品孔中加入10ul待测样品。分别加pbs定容至20ul。各孔中加入200ulbca工作液,室温放置2小时。用酶标仪测定蛋白浓度:测定a562,依标准曲线算出蛋白浓度。
牛血清白蛋白sds-page电泳
1 制 胶: 按比例配制分离胶,缓缓地摇动溶液,使激活剂混合均匀,将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃j中,再在液面上小心注入一层水,以阻止氧气进入凝胶溶液中,静置40min。同前按比例配制浓缩胶,但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分,连续平稳的注入凝胶溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡,静制60min以上以保证聚合。
2 预电泳: 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中,小心拔去梳子,加入电泳缓冲液后低电压10-20v的预电泳20-30min。(目的是清除凝胶内的杂质, 疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通)。
3 样品准备:首先计算上样体积,然后按样品:上样buffer=4:1的比例加入上样bufer混匀,沸水10分钟,冰上5分钟。
4 加 样: 预电泳后依次加入标准品(marker)和待分析样品。(加样时间要尽量短,以免样品扩散,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul 。
5 电 泳: 加样完毕,选择80v恒压进行电泳,电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处(一般约20分钟),更换至100v恒压电泳,电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处,即停止电泳(一般约为1小时20分钟)。
