trizol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总rna无蛋白质和dna污染，可用于northern blot，dot blot，ploya筛选，体外翻译，rnase保护分析和分子克隆。在用于rt-pcr时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无rnase的dnaseⅰ处理rna样品，避免出现假阳性。共纯化的dna可用作标准，比较不同样品rna的得率，也可用于pcr和酶切。蛋白质可用于western blotting。
预防rnase污染注意事项：
1． 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为rnase的来源。
2． 使用灭过菌的rna专用塑料制品避免交*污染。
3． rna在trizol试剂中时不会被rnase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含rnase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5m naoh中浸泡10分钟，然后用水彻di清洗，高压灭菌，即可去除rnase。
4． 配制溶液应使用无rnase的水（将水加入处理过不含rnase的玻璃瓶中，加入depc至终浓度0.01℅v/v,放置过夜,高压灭菌。注：depc有致癌之嫌，需小心操作。）
rna的提取
准备试剂：lv仿，异丙醇，75℅乙醇，无rnase的水或0.5℅sds(溶液均需用depc处理过的水配制)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml trizol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过trizol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入trizol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。trizol加量不足可能导致提取的rna有dna污染。
c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml trizol，反复吸打。加trizol之前不要洗涤细胞以免mrna降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物wan全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量dna，上清中含有rna。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。rna主要在水相中，水相体积约为所用trizol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离dna和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的rna。每使用1ml trizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出rna沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗涤rna沉淀。每使用1ml trizol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
10.室温放置干燥或真空抽干rna沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致rna的溶解性大大降低。加入25-200μl无rnase的水或0.5℅sds,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使rna溶解.如rna用于酶切反应,勿使用sds溶液。rna也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。
注意事项：
1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取rna时可加入少许糖原以促进rna沉淀。例如加800ml trizol匀浆样品，沉淀rna前加5-10μg rnase-free糖原。糖原会与rna一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响pcr反应。
2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。rna沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3．分层和rna沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。
预期产量：1mg组织或1×106细胞提取rna分别为：
肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg 。
常见问题分析：
得率低：
a.样品裂解或匀浆处理不彻di底
b．rna沉淀未wan全溶解
a260/a280<1.65 ：a.检测吸光度时，rna样品没有溶于水，而溶于了te中。低离子浓度和低ph值条件下a280值偏高
b．样品匀浆时加的试剂量太少
c．匀浆样品时未在室温放置5分钟
d．吸取水相时混入了有机相
e．rna沉淀未wan全溶解。
rna降解：
a.组织取出后没有马上处理或冷冻
b.待提取rna的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
c.细胞在用胰酶处理时过度
d.溶液或离心管未经rnase去除处理
e.电泳时使用的甲醛ph值低于了3.5
dna污染:
a. 样品匀浆时加的试剂量太少
b.样品中含有有机溶剂(如乙醇,dmso等),强缓冲液或碱性溶液
蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀rna的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1ml trizol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8m柠檬酸钠和1.2m nacl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯rna。从含有大量多糖的植物中提取rna时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。
dna的分离
准备试剂：乙醇 0.1m柠檬酸钠(含10%乙醇) 75%乙醇 8mm naoh
操作步骤:
1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的dna。每使用1ml trizol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8℃不超过2000×g离心5分钟。
2. 移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1m柠檬酸钠洗涤dna沉淀。每用1ml trizol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2-8℃2000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。
3. 用75%乙醇再洗一遍dna沉淀，每用1ml trizol加入1.5-2 ml 75%乙醇,室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8℃2000×g离心5分钟, 弃上清。
4. 室温放置晾干dna 5-15分钟，用8mm naoh溶解dna。从50-70mg组织或107细胞中分离的dna溶于300-600μl 8mm naoh，dna的浓度通常为0.2-0.3μg/μl 。提取的dna沉淀不易溶于水和tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mmnaoh的ph值为9，溶解dna后可用te，hepes调节ph。从某些样品（尤其是组织）中提取的dna中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。
dna的定量：取一份溶于8mm naoh的dna加水测a260值。一单位a260值相当于50μg/ml双链dna。根据dna产量可估计细胞数，人，大鼠，小鼠1×106二倍体细胞含dna的量分别为7.1μg , 6.5μg , 5.8μg 。
预期产量：1mg组织或1×106细胞提取dna分别为肝和肾3-4μg 骨骼肌，脑组织，胎盘2-3μg 人，大鼠，小鼠培养细胞（1×106）5-7μg 成纤维细胞5-7μg
应用：1.用于pcr 溶于8mm naoh的dna用0.1m hepes调ph至8.4,取0.1-1μg dna用作模板。
2.酶切反应 用hepes或1mm edta调节ph至适当值。每μg dna使用3-5单位的酶，80-90%的dna是可消化的。
1ml 8mm naoh溶解的dna样品ph值调节
final ph 0.1m hepes(μl) final ph 1m hepes(μl)
8.4 86 7.2 23
8.2 93 7.0 32
8.0 101
7.8 117
7.5 159
注意事项：
1. dna在中间层和有机相中时可在2-8℃保存过夜。
2．dna沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存几个月。
3．dna在8mm naoh溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用hepes调节ph至7-8并且加edta至1mm，可置于4℃或-20℃长期保存。