当前polya尾的检测分为两种思路：
①与加帽率的分析策略类似，酶切后纯化回收3’端polya尾，随后通过毛细管电泳（ce）、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）、高效液相色谱（hplc）或液相色谱质谱联用（lc-ms），对polya尾进行定性和定量分析。
②基于二代或三代测序技术表征polya，已报道的测序方法包括tail-seq、pal-seq、flam-seq和paiso-seq等。
2018年诺华公司beverly m等发表在anal bioanal chem杂志的一篇文章，《poly a tail length analysis of in vitro transcribed mrna by lc-ms》，研究基于rnase t1酶切与oligo dt磁珠纯化得到polya尾，使用液相色谱质谱联用（lc-ms）检测polya尾长度的分布，目前该策略是当前mrna体外制备工艺中较为常用的方法。
2022年brouze a等发表在wiley interdiscip rev rna期刊的一篇综述，《measuring the tail: methods for poly(a) tail profiling》，总结了利用二代（illumina）或三代（pacbio）测序与rna直接测序平台检测polya尾，可在分析polya长度分布的同时表征序列的完整性和准确性。
一、基于内切酶与lc-ms平台的polya尾检测
mrna样品制备
一步法加尾：设计模板序列，包括不同长度polya尾（27-112 nt），体外转录（ivt）制备mrna样品。
酶法加尾：模板序列不包括polya，使用大肠杆菌来源的polya聚合酶进行mrna的加尾修饰。制备得到的mrna进行琼脂糖凝胶电泳，确认mrna样品的长度和完整性。以10 nt和20 nt 的polya为标准品。
rnase t1酶切与磁珠纯化
①酶切：内切酶rnase t1可特异性地在单链rna的鸟嘌呤核糖核苷酸（g）后进行切割。100 pmol mrna加热至95℃后迅速降至25℃，随后加入10×rnase h缓冲液、2 μl rnase t1酶（100 μl体系），37℃孵育3小时。
②纯化：通过polya尾与oligo dt磁珠特异性结合进行纯化，使用0.1 m醋酸铵溶液清洗磁珠，随后加入75%甲醇，80℃孵育1 min，洗脱polya片段。③换液：通过旋转蒸发去除甲醇，重悬于含1%甲醇的0.1 mm edta溶液，用于lc-ms分析。
lc-ms分析
使用高分辨液相质谱联用仪，固定相为acquity c18色谱柱，流动相a为200 mm六氟异丙醇+8.15 mm三乙胺（ph 7.9），流动相b为100%meoh。
洗脱条件为：5%b洗脱1min，1-12 min内b浓度由5%线性增加到25%，然后90%b冲洗1min后恢复5%b。紫外波长设置为260 nm。
不同加尾方法得到的polya尾长度评估
与利用质粒模板转录生成polya相比，酶法加尾的mrna样品的出峰更宽，polya尾长度的分散性更大。
图1:不同加尾方法得到的polya尾分布（离子色谱图）
hplc与ms的分辨率
当polya长度为27 nt时，高效液相色谱（hplc）可有效分离相差一个腺苷的polya，但当碱基个数增加至64或100，hplc未能有效分离相差一个腺苷的polya（图2a）。而质谱（ms）可弥补这一缺陷，当polya长度为100 nt，电喷雾质谱图可精确检测任一不同分子量的polya（即不同长度的polya），通过峰强度对polya长度分布进行相对定量（图2b）。
图2: mrna样品的polya尾分析（上图为离子色谱图,下图为电喷雾质谱图）
如上所述，文章介绍了一种分析mrna polya尾长的方法。该方法基于rnase t1将polya从mrna序列上切割下来，通过dt磁珠特异性捕获polya，然后借助lc-ms的高分辨率，定量分析mrna的polya尾长度分布。
基于该策略的可替代方法包括：根据核苷酸序列特性，使用其他rna酶（如rnase a或rnase h）代替rnase t1，以获得polya片段，随后通过毛细管电泳、hplc对短核苷酸进行分离与定量分析。
二、基于测序平台的polya尾检测
有研究报道，可利用illumina二代测序、pacbio三代测序与纳米孔rna直接测序平台分析polya，测序原理及流程如下：
基于illumina平台分析polya尾
illumina rna-seq的原理是通过富集mrna（polya富集）或去除rrna，产生片段化的rna序列，然后将rna逆转录生成双链cdna，在片段末尾加入测序接头后进行pcr扩增。cdna分子聚集在流动池，通过dna合成体系中的3’端feng锁荧光标记的核苷酸底物读取荧光信号，从一端（单端测序）或两端（成对末端测序）进行测序。
常用的方法包括tail-seq和pal-seq，借助于制备完整的包括polya尾在内的3’端mrna测序文库。首先将rna与生物素化的3’端dna接头连接，并用rnase t1部分酶切，留下完整的polya尾，随后使用链霉亲和素磁珠捕获3’端片段。通过凝胶电泳筛选不同条带，并与5’端接头连接，为逆转录、文库扩增和测序提供完整的模板。如图3所示，pal-seq和tail-seq的不同在于dna接头，tail-seq仅存在一个单链dna接头，测序过程需去除rrna。而pal-seq技术除单链dna接头外，还存在一端与polya尾和3’端接头互补的dna寡核苷酸序列，提高了连接效率，因此不需去除rrna。
illumina测序技术的不足在于，由于polya的长多聚物特性，容易产生pcr扩增的偏倚，保真度较低，序列准确性较低。
图3:基于illumina平台的polya尾测序方法
基于pacbio平台分析polya尾
不同于illumina短cdna片段合成测序的方法，pacbio采用单分子实时测序技术，在处理均聚物的效果优于illumina，可对全长rna分子进行测序，提供有关polya的长度和序列信息。
常用方法包括flam-seq和paiso-seq。如图4所示，两种方案的主要步骤是3’端延伸、逆转录、cdna扩增、环状接头连接和pacbio测序。
二者的不同点为：
flam-seq首先选择带有polya尾的mrna，随后对其进行g/i加尾。逆转录引物由5’末端的pcr handle组成，然后在模板置换寡核苷酸（tso）的情况下合成第二链，最后将合成的双链cdna扩增并进行pacbio测序。
而paiso-seq首先与oligo dt结合，3’末端延伸，经user降解oligo dt寡核苷酸，随后经逆转录、pcr扩增双链cdna并进行pacbio测序。pacbio具备均聚物测序能力，可用于分析polya尾的序列组成。
图4:基于pacbio平台的polya尾测序方法
基于纳米孔rna直接测序平台分析polya尾
纳米孔rna直接测序平台由oxford nanoporetechnologies（ont）推出，与二代、三代测序相比，纳米孔rna直接测序技术分析polya尾不需进行pcr，流程如图5所示，将3’端接头连接至mrna（含polya），逆转录（可选操作）后连接至3’端测序接头（与动力蛋白连接），随后被加载到纳米孔形成的流动池，施加电压后，在动力蛋白驱动下，rna由3’端至5’端通过纳米孔，根据特异性电流信号分辨碱基序列。纳米孔rna直接测序平台不需切断mrna序列，直接读取全长序列；该平台不依赖于逆转录和pcr反应，可以同时表征序列的完整性、准确性和核苷酸修饰。
图5:基于纳米孔rna直接测序平台的polya尾检测方法
三、结语
2018年beverly m等使用内切酶rnase t1进行特异性切割，利用磁珠分离得到5’端polya尾，随后通过lc-ms有效分离不同分子量大小的核苷酸序列，从而定量分析polya尾长度分布。该方法是体外合成mrna polya尾的常用表征方法。
随着测序技术的发展，科学家们开始基于测序平台分析polya尾长度。基于illumina平台的tail-seq和pal-seq技术，以及第三代测序技术pacbio平台，通过构建cdna文库对polya尾或全长mrna进行测序，可检测polya尾长度和序列完整性。但二者均依赖于pcr扩增cdna，长均聚物的存在导致pcr扩增不可避免地存在偏差，可能对polya尾长和序列准确性造成影响。ont开发的直接测序方法，不依赖于逆转录与pcr扩增，可以实现polya尾部长度及序列准确性的检测，不存在pcr偏倚性。然而以tailseq、palseq、flamseq、patseq及纳米孔测序为代表的测序技术通量大、设备要求高，鉴于体外合成的mrna通量较小，无法体现测序技术的高通量优势。
参考文献：
[1] beverly m, hagen c, slack o. poly a tail length analysis of in vitro transcribed mrna by lc-ms. anal bioanal chem. 2018 feb;410(6):1667-1677. doi: 10.1007/s00216-017-0840-6.
[2] brouze a, krawczyk ps, dziembowski a, et al. measuring the tail: methods for poly(a) tail profiling. wiley interdiscip rev rna. 2022 may 26:e1737. doi: 10.1002/wrna.1737.
[3] 药品审评中心. 新型guan状病毒预防用mrna疫苗药学研究技术指导原则（试行）. 2020.
[4] usp. analytical procedures for mrna vaccines–draft. 2022.
转自耀海生物
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