1．观察程序：应在低倍镜下观察整张fish切片，初步判断检测质量以及是否存在her2扩增的异质性。要求至少找到2个浸润癌区域，计数至少20个浸润癌细胞。也可以参照ihc切片先确定可能存在扩增的浸润癌区域，然后于100倍物镜下通过特异通道滤光片观察her2和cep17信号，并进行信号计数和比值计算。
2．结果判读及注意事项：应选择细胞核大小一致、核的边界完整、二脒基苯基吲哚(dapi)染色均一、细胞核无重叠、信号清晰的细胞。随机计数至少20个浸润癌细胞核中的双色信号。在观察信号时，应根据情况随时调节显微镜的焦距，准确观察位于细胞核不同平面上的信号以免遗漏。判读标准如下图--双探针ish：
(1)当her2／cep17比值≥2.0时，为her2阳性；her2／cep17比值<2.0，但平均her2拷贝数／细胞≥6.0时也为her2阳性。扩增细胞应均质、连续，且占浸润癌的10％以上。需要注意的是对于her2／cep17比值≥2.0，但平均her2拷贝数／细胞<4.0的病例是否应该视为ish阳性目前尚存一定争议。建议对这部分病例在报告中加以备注，提示目前的认识争议，建议临床医师参考ihc检测结果并与患者进行必要的沟通。
(2)her2／cepl7比值<2.0且平均her2拷贝数／细胞<2.0时为her2阴性。
(3)her2／cep17比值<2.0且平均her2拷贝数／细胞<6.0，但i>4.0时为her2 ish结果不确定。单探针ish：肿瘤细胞平均her2拷贝数／细胞<4．0为无扩增；肿瘤细胞平均her2拷贝数／细胞≥6.0为扩增。扩增细胞应均质、连续，且占浸润癌的10％以上。平均her拷贝数／细胞在4～6之间为不确定。若众多her2信号连接成簇时可不计数，直接视为基因扩增。对于ish结果不确定的病例．需要再计算20个细胞核中的信号或由另外一位分析者重新计数。如仍为临界值，则应行ihc检测(若fish前未行)，也可以选取不同的组织块重新检测。建议在her2 fish检测报告中包括如下内容：患者信息(包括姓名、性别、年龄、门诊／住院号)、送检医师姓名、送检日期、标本信息(包括病理号和蜡块号)、标本部位和类型、探针信息、检测方法、是否使用图像分析、对照设置情况、样本量是否适合评估、判读结果(包括评估的细胞数量、平均her2拷贝数／细胞、平均cepl7拷贝数／细胞、平均her2拷贝数／平均cepl7拷贝数的比值)、检测结论(如阳性、不确定、阴性、无法判读)。
3．质量控制：(1)内对照：使用上述同时含有her2基因和cepl7序列的混合探针时，组织中≥75％的细胞核显示出双色信号时视为杂交成功，并且双色信号互为对照，癌与非癌细胞互为对照。出现下列情况时应视为fish检测失败，包括：①对照样本未出现预期结果；②浸润癌病灶太小，难以观察到两个浸润癌区域并计数；③可计数信号的细胞<75％；④>10％的荧光信号位于细胞核外；⑤细胞核结构难以分辨；⑥有强的自发荧光。(2)外对照：应选择已知fish阳性和阴性的标本片(或采用厂家提供的对照片)作为外对照，且杂交染色结果与预期相符。(3)如有可能，建议设置低扩增对照。
4．关于第17号染色体数目：fish双探针检测中加入cepl7探针的目的是为了在检测her2基因的同时检测第17号染色体数目，从而将第17号染色体的非整倍体和单纯的her2基因扩增，尤其是低水平的扩增区分开。但近年来的研究显示整条第17号染色体的多体罕见，cep17的多体并不能代表整条第17号染色体多体。部分乳腺癌中第17号染色体存在her2基因和着丝粒的共同扩增。越来越多的学者认为，与her2／cepl7比值相比，her2拷贝数对于her2基因扩增的判断更为重要。因此在her2 fish检测结果中除报告her2／cepl7比值外，还应分别报告her2拷贝数和cepl7的数值。
5．关于her2基因的异质性：浸润性乳腺癌中her2表达或扩增可存在异质性。虽然her2基因异质性的临床意义目前仍不明确，但它可导致ihc与ish检测、原发灶与转移灶、穿刺标本与手术切除标本的检测结果不一致。在ish计数之前，应观察整张切片或使用ihc确定可能存在her2扩增的区域。需要强调的是，即使存在异质性，但只要扩增细胞连续、均质，且占浸润癌10％以上，就应明确报告为ish阳性。可补充报告不同细胞群(>10％)的计数值(包括计数的细胞总数、her2拷贝数、cepl7数值、her2／cepl7比值)，并报告扩增细胞群占所有浸润癌细胞的比例。