ps：该方法适用于检测或部分 dna 片段克隆，不适合全长基因克隆
反转录 pcr 的主要问题是基因组 dna （gdna） 污染的存在，这将导致产生假阳性信号，特异性降低或对特定 rna 的过高估计。为了消除 rt-pcr 中 gdna 的干扰，可将引物设计为与两个外显子的接合部退火，该点为 cdna 序列专有，因此 gdna 将不能被扩增。
cdna 特异的引物可通过三个途径设计（如下图所示）
1. 引物横跨外显子-外显子接合部。设计的引物如果一半与一个外显子的 3'端结合，而 另一半与相邻外显子的 5'端结合，它将只与 mrna 或由已剪切的 mrna 合成的 cdna 退 火，而不与 gdna 结合，因而可以避免对 gdna 污染的扩增。正向或反向引物都可设计为 横跨外显子接合部；而另一个引物可设计为结合于另一个外显子接合部或在*位于外显子 内部的位点上。
2. 外显子*配对-内含子交叉配对引物。为了从 cdna 和 gdna 混合物中选择性地扩增 gdna, 设计的引物应与外显子-内含子接合部退火，这种引物叫做外显子*配对-内含子交叉配对（exon-primed intron-crossing，epic） 引物（bierneetal. 2000）。epic 引物可 在系统发育研究中用于扩增同源的内含子区域，因为外显子序列相对内含子而言更保守。
3. 引物位于外显子-外显子接合部的侧面。设计的 rt-pcr 引物位于至少含一个内含子 的区域的侧面。这样以 cdna 为模板扩增的片段要小于以 gdna 为模板扩增的片段，这种 大小的差异可以帮助检测 gdna 污染的存在。