1. 取 1.5ml 细菌培养物于 ep 管中， 4000rpm 离心 1 分钟， 弃上清液， 使细菌沉 淀尽量干燥；
2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的 100 μl 溶液 i (50 mmol/l 葡萄糖， 10 mmol/l edta ph 8.0 ，25 mmol/ltris-hcl ph 8.0) 中，剧烈振荡；
3. 加入 200 μl 新配制的溶液 ii(0.2 mol/l naoh ，1％sds（m/v）)，盖紧 ep 管 口，快速颠倒离心管 5 次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液 ii 接触，不要涡旋，置于冰浴中；
4. 加入 150 μl 预冷溶液 iii(每 100 ml 的溶液 iii 中含 60 ml 5 mol/l 乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸， 28.5 ml h2o)，盖紧 ep 管口，反复颠倒数次，使溶液 iii 在粘稠 的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上 3~5 分钟；
5. 在最大转速下离心 5min，取上清液于另一新 ep 管；
6. 用两倍体积的乙醇室温沉淀双链 dna，振荡混合于室温放置 2 分钟， 最大转 速离心 5 分钟；
7. 小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；
8. 加 1ml 70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用 12,000g 离心 2 分钟，弃上清，将 开口的 ep 管置于室温使乙醇挥发， 直至 ep 管中内没有可见的液体存在（5 ~ 10 分钟），用适量的 ddh2o 溶解；
9. 用 0.5μl 的 rnase 37℃温育 5~10 分钟；
10. 电泳鉴定。
乙醇沉淀dna
1. 加入 1/10 体积的乙酸钠（3mol⁄l，ph=5.2）于 dna 溶液中充分混匀， 使其 最终浓度为 0.3 mol⁄l；
2. 加入 2 倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中 15~30 分钟；
3. 12,000 g 离心 10 分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
4. 加入 1/2 离心管容量的 70％乙醇， 12000g 离心 2 分钟， 小心移出上清液， 吸 去管壁上所有的液滴；
5. 于室温下将开盖的 ep 管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；
6. 加适量的 ddh2o 溶解 dna 沉淀。
酶 切
1. 酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套 buffer。 2. 在离心管中加入如下成分：
10 ×buffer 1μl
待切样品 xμl
酶 0.5-1μl
加水补足 10μl
3. 混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。
4. 将离心管置于 37℃中温育 1-3hr，若待切样品为 pcr 产物， 则可将反应时间 适当延长。
5. 用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
注：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。双酶 切可选用二者活性都较高的 buffer 或者通用 buffer，但要注意不能有星反应。）
连 接
1. 连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。
2. 在离心管中加入如下成分：
10 ×连接 buffer 1μl
待连接的样品（胶回收产物或 pcr 产物，载体与片段的 mol 比为 1∶3-5）
连接酶 0.5-1μl
加水补足 10μl
3. 混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。
4. 将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求
而定， 一般为 22℃ 1-3hr 或 16℃连接过夜）。
连接完的样品可直接用于转化，也可放 4℃冰箱短期保存。