克隆是英文“clone”或“cloning”的音译，而英文“clone”则起源于希腊文“klone”，原意是指以幼苗或嫩枝插条。1963年j.b.s.haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆（clone）”的术语，把“克隆技术”带到了人们的视野中。
克隆技术又称为“生物放大技术”，目前应用泛的技术为“分子克隆”，又称重组dna技术，即通过重组技术将目的dna片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生新的遗传性状的技术。
之前小翌给小伙伴们介绍了常规的分子克隆方法，接下来继续带领大家认识一下新的、非常规的分子克隆技术，包括无缝克隆中的golden gate技术、gateway技术、不依赖基因序列和连接反应的克隆方法等等。
01golden gate技术golden gate克隆在2008年由engler等人提出，是依赖iis型限制酶的无缝克隆技术，能媲美gibson assembly，主要用于多片段克隆组装。实验步骤与传统克隆技术相似，但限制性内切酶酶切原理不同。传统酶切使用的typeii型限制性内切酶通常识别4-8 bp的回文序列，并在识别序列内部切割产生粘性末端或平末端。golden gate克隆技术通过typeiis型限制性内切酶（翌圣bsmbi cat#15203es、bspqi限制性内切酶cat#15202es、funicut™bsaicat#15005es）识别目的序列以外的四个碱基，剪切后获得粘性末端，直接用于目的片段的连接。通过连接酶（翌圣t4 dna连接酶cat#10300）连接形成重组质粒，使用转化技术转化至感受态细胞中，由于限制性内切酶的特性，酶切连接后酶切位点不再存在，能达到精确的无缝克隆。engler等人利用该技术成功连接了9个目的片段，连接率达90%以上。
图1. golden gate assembly克隆原理示意图【1】
02gateway技术gateway技术最早在1990s年被发现应用，主要用于表达载体、rnai干扰载体等载体的构建。其原理利用噬菌体的特性：即噬菌体dna会定点整合到细菌宿主基因组上。科学家们研究发现，噬菌体和细菌内均含有重组位点attp和attb，能有效帮助噬菌体入侵宿主细胞，从而将噬菌体dna插入到细菌基因组上，同时在重组位点上产生两个新位点：attl和attr，该过程可逆。
gateway构建表达载体实验流程如下图：
图2. gateway技术构建表达载体【2】
此技术的优点在于利用位点特异重组成入门载体后，不再受到酶切位点和连接酶的限制，可以多次转移到其他载体上。再加上供体载体含有ccdb致死基因，会杀死重组不成功的质粒，所以阳性克隆率高，但受控于存在的介导蛋白和重组位点。此外，需要注意的一点是，进行重组反应时需要使用对ccdb敏感的大肠杆菌菌株，如翌圣dh5α化学感受态细胞（cat#11802es）、翌圣化学感受态细胞（cat#11801es），能抑制大肠杆菌菌株的生长繁殖，进行负筛。
03不依赖基因序列和连接反应的克隆方法（slic）2007年，来自于哈佛医学院的li等人建立了不依赖序列和连接的克隆方法（sequence and ligation-independent cloning，slic）。slic方法不受目的序列和连接反应的限制，能将任意、多个dna片段组装起来，在体外完成重组反应，用途非常广泛。
基本操作流程如下：
01pcr扩增目的片段，在片段两端分别加上15-30 bp的同源序列；02利用t4 dna聚合酶的3'-5'外切酶活性，在22℃条件下消化dna片段，产生含有同源序列的5'-ssdna突出端。突出端长度可通过dctp控制；03将处理后的目的片段置于t4 dna连接缓冲液中，于37℃完成突出单链的复性重组，形成含有缺口的环状中间体，直接转化细胞；04利用大肠杆菌自身的修复系统使其形成完整的环状质粒。
图3.slic法构建表达载体的步骤【3】
04细胞裂解物体外无痕连接细胞裂解物体外无痕连接（slice）是利用细胞裂解物而进行体外无痕组装dna的方法，能一步组装多个目的片段。它在2012年由zhang等人提出，在2013年由fisher等人进行优化和改进，扩增了可用于该技术的细胞裂解物，此外，itaya等人发现枯草芽孢杆菌本身就具有可用于片段组装的同源重组系统，进一步扩展了可用的细胞裂解物来源。相比于其他不依赖限制性内切酶和连接酶的技术，slice方法使用的细胞裂解物更易获得和保存，实验成本更低，适用于大多数基础实验室。其具体的操作步骤是，利用pcr技术在目的片段两侧分别加上20-25 bp的同源序列，用dpni酶（翌圣funicut™ dpni cat#15052es）消化处理，组装片段按合适的比例混匀，加入大肠杆菌细胞裂解物，37℃反应1 h，然后直接转化大肠杆菌感受态细胞，即可实现体外无痕组装dna。
图4.slice技术【4】
通过上述两篇专题，小翌介绍了一些传统的、应用范围广的、新型的分子克隆方法，希望对各位科研er们的日常实验有所帮助和启发。随着近几年基因编辑技术、合成生物学技术的迅猛发展，分子克隆技术越来越趋于高效化、多样化，其中的每一项内容都值得我们去探究。关注我们，小翌会在下一期的分子克隆技术专题中给大家具体讲解分子克隆技术中应用到那些技术，为您的实验带来新的思路与方向，期待下一次的见面~
05相关产品列表
产品定位
产品名称
产品货号
规格
golden gate组装
bspqi限制性内切酶 (10 u/μl)
15202es76
500 u
golden gate组装
bsmbi（10 u/μl）
15203es80
1000 u
通用缓冲液，5min完成精准酶切
funicut™快速限制性内切酶
15001es-15051es
50 t
t4连接
hieff® gold t4 dna ligase
10300es80
1000 u
5 min快速完成感受态转化
f dh5α化学感受态
11803es80
10×100 μl
常规化学感受态
dh5α 化学感受态细胞
11802es80
10×100 μl
常规化学感受态
化学感受态细胞
11801es80
10×100 μl
常规pcr
2×hieff®pcr master mix(with dye)
10102es03/08
1 ml/5×1 ml
常规pcr，不含染料
2×hieff®pcr master mix(no dye)
10103es03/08
1 ml/5×1 ml
快速pcr，快至1s/kb
2×hieff®ultra-rapid hotstart pcr master mix(with dye)
10157es03/08
1 ml/5×1 ml
06参考文献1.engler c,gruetzner r,kandzia r,et al.golden gate shuffling:a one-pot dna shuffling method based on type iis restriction enzymes.plos one,2009,4(5):e5553.2.林春晶,韦正乙,蔡勤安等.几种植物转基因表达载体的构建方法[j].生物技术,2008(05):84-87.3.张阳璞,杨淑慎.几种新型植物基因表达载体的构建方法[j].生物工程学报,2015,31(03):311-327.4.杨发誉,杨云彭,霍毅欣.合成生物学中不依赖限制性内切酶的分子克隆策略[j].中国生物化学与分子生物学报,2018,34(04):364-370.