绿色植物中叶绿素含量是测定植物所需氮含量的重要因素，是植物进行光合作用的关键因素，因此对植物的生理学研究也是个重要的考核指标。叶绿素测定仪通过测量叶片在两种波长范围内的透光系数来确定叶片当前叶绿素的相对数量,也就是在叶绿素选择吸收特定波长光的两个波长区域，根据叶片透射光的量来计算测量值。
叶绿素测定仪的测定原理是根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度a与其中溶质浓度c和液层厚度l成正比，即a=αcl式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
若测定叶绿体色素混合提取液中的叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度a，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数可求得其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，通常用单色光的波长选择叶绿素在红光区的大吸收峰。