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CCK-8 细胞增殖和细胞毒性实验

2024/4/26 4:16:55发布6次查看
该试剂中含有wst-8,在电子载体1-methoxy pms的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(formazan dye)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。用途:广泛用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
特点:对细胞毒性小,可以多次测定选取最佳测定时间;检测迅速;灵敏度高。
实验步骤:
1.种板数:根据你摸索的,或者查阅文献确定你需要的种板浓度,根据种板浓度对细胞悬液进行稀释,通常细胞增殖实验每孔加入约1000-2000个细胞100ul,细胞毒性实验每孔加入约5000~10000个细胞100ul(具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度的快慢等决定)。
2.种板:以96孔板为例,96孔板横向是1-12的数字,纵向是a-h,可做多个实验组,每组设置4-6个复孔,同时设置空白组,最边缘孔加入pbs缓冲液减少蒸发带来的影响,然后将细胞置于37℃ 5%co2细胞培养箱中培养12-24 h。
3.加药及加药后孵育时间:观察细胞细胞贴壁良好,吸出各孔培养基,实验组加入含不同浓度药物的培养基,空白组加入不含药物培养基,然后将96孔板在37℃ 5% co2空气的细胞培养箱中孵育适当时间,根据不同实验细胞需求选择适当的孵育条件和时间。
4.加入cck-8:两种方法,每孔直接加入10ul的cck-8溶液,或者配置成含10%cck-8溶液的培养基以换液的形式加入,注意加入过程中避免产生气泡,可以将枪头浸入培养液中缓慢加入。
5.加入cck-8后孵育时间:将加完cck-8的培养板放入37°c 5%co2 培养箱中孵育1-4h,cck-8试剂加入后孵育时间也需要自己摸索,随着时间的增加,od值就会增大。可以在0.5h、1.0h、2.0h分别测od值,把od值控制在1.0左右。
6.测od值:将96孔板取出,酶标仪检测各孔在450nm波长处的od值,分析处理数据,绘制增殖曲线。
7.结果分析:
a.细胞存活率:将各测试孔的od值减去本底od值(空白组)各重复孔的od值取平均数±sd。
细胞存活率% =(加药细胞od/对照细胞od)×100%。
b. 求出t/c = 50% 时的药物浓度(ic50)及t/c = 10%时的药物浓度(ic90)。
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