您好,欢迎来到三六零分类信息网!老站,搜索引擎当天收录,欢迎发信息
免费发信息

PCR反应体系解析

2024/4/25 2:54:21发布4次查看
pcr反应体系解析如下:
1、引物
引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸,最高不宜超过30个核苷酸,最佳长度为20-24个核苷酸,如需插入酶切位点,应在酶切位点5'端多加几个碱基,有利于酶切。引物的(g+c)%含量组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体;两个引物中(g+c)%含量应尽量相似;引物内部应避免形成明显的二级结构,如发夹结构;两个引物之间不应发生互补;特别是在引物3'端最好有富有gc,这样退火后有利于3'端的延伸。人工合成的引物需经过色谱层析或page纯化,以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-1μm左右,浓度太高会导致非特异性扩增,太低则扩增产物太少。
2、模板
模板可以是单链dna,也可以是双链dna,质粒dna的扩增效率略低于线状dna。模板量一般不需太多,不超过1μg为宜,因为模板量过多可能导致非特异性扩增增加,但是要考虑模板中靶序列的含量。例如:使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列,就需要适当加大模板用量。
3、缓冲液buffer
缓冲液的ph值,盐离子浓度、助溶剂成分等都会对pcr反应产生影响。taq酶通用缓冲液ph值为8.4。mg2+浓度为1.5mm,可以适用于大多数pcr反应,但它并非对任何模板和引物的组合都是最佳的。
4、dna聚合酶
50μl反应体系可用0.5-5u酶,酶量的选择与模板dna的量、扩增片段大小等有关,酶量过多易发生非特异性反应,而且可能增加突变的机率,尤其在进行高保真扩增时,应尽量减少酶量,但酶量过少时反应性能会下降。
该用户其它信息

VIP推荐

免费发布信息,免费发布B2B信息网站平台 - 三六零分类信息网 沪ICP备09012988号-2
企业名录