脾脏是机体重要的免疫器官之一，含有大量的淋巴细胞，占全身淋巴组织总量的25%，在小鼠中，由于小鼠血液量少，从外周血液中分离大量淋巴细胞较为困难，故经常需要从其脾脏中获取大量的淋巴细胞。
不久前，来自华中科技大学同济医学院附属同济医院的李老师在biomaterials杂志上发布的文章中就用到了上述实验。以下为是李老师分享的一些相关经验。
操作步骤
1 材料准备
选取具有正常免疫功能的成年小鼠（所需的小鼠数量根据实验需要决定，通常一只小鼠脾脏可提取的淋巴细胞数量为2~6×107），快速断颈处死(避免脾梗死)后，浸泡于75%酒精中；准备好已消毒的眼科剪、眼科镊，以及一个装有一定量pbs的无菌皿，分离脾脏后置于皿中，全程无菌操作；
2 小鼠脾脏处理
脾脏细胞数量较少时，可用两个1ml无菌注射器的针尖将脾脏戳出大量的空洞后，轻轻刮取脾脏表面，将脾脏细胞刮出；数量较多时，可用细胞滤网进行研磨后离心，也可得到淋巴细胞。
3 离心
15ml离心管中吸入5ml ficoll分离液，倾斜管身，小心吸取含淋巴细胞的pbs缓慢加入ficoll分离液，可见明显液体分层。600rpm梯度离心25分钟，升速/降速均为2；
4 二次离心
得到分为3层的液体, 小心吸取中间层液体（含淋巴细胞+红细胞）并置于新的15ml离心管，补满pbs，600rpm离心5分钟；
5 三次离心
弃上清pbs, 可见黑红色沉淀，加入1~2ml红细胞裂解液，冰上裂解5分钟，补满pbs, 600rpm离心5分钟；
6 获取淋巴细胞
弃上清pbs, 可见白色沉淀，此为总淋巴细胞；计数；
7 重悬淋巴细胞
将提前过夜包被cd3抗体(包被浓度为5ug/ml)的96孔板中的pbs吸弃，配制淋巴细胞培养基，1640全培+巯基乙醇+cd28抗体(终浓度2.5ug/ml)，重悬淋巴细胞并加入96孔板，100~200ul/孔，通常淋巴细胞数量为1~3×105个/孔。通常8个小时即可看到t细胞增殖团，刺激48h后可以较好活化t淋巴细胞；
8 分选
若实验目的为分选cd4/cd8 t淋巴细胞，可以省去红细胞裂解操作，直接用磁珠抗体对淋巴细胞进行避光孵育，并用pbs洗掉多余的试剂后，弃上清，用一定量pbs重悬淋巴细胞，缓慢加入预先润湿过的macs tube(已安装到磁力架上)。根据具体试剂和目的可以分为阴选和阳选：阴选需要从分选柱中流下的液体，其中含有目的细胞；阳选则应该等待分选柱中的液体流尽后，将分选柱从磁力架上取下后，并重新加入pbs将分选柱中的阳选细胞冲下，其中含有目的细胞。计数，此后步骤同总淋巴细胞。
注意事项
1 由于整个过程需要淋巴细胞长时间处于体外pbs中，所以对pbs的要求比较严格；为保护淋巴细胞，也可以使用专门的淋巴细胞缓冲液，或自行配制含0.4%bsa的pbs缓冲液；
2 有些研究为了更好地促进淋巴细胞的杀伤功能，还会在t细胞培养基中添加il-2; 但是，很多人认为这样也会加速t细胞进入t细胞耗竭的进程，同时会缩短t细胞寿命；
3 若后续需要进行流式分析，无法再染cd3 和 cd28分子；
4 若用到了ot-i cd8 t细胞，则无需cd3抗体刺激，而是用ova抗原刺激活化第一信号；
5 以上所有操作均以无菌试剂、耗材，无菌环境内操作为前提。
以上为淋巴细胞提取、分选的经验分享，希望对大家有所帮助。同时也欢迎更多老师参与文献奖励活动，分享您的科研干货和心得体会！