溶液和试剂
裂解缓冲液
这些缓冲液可在4℃ 下保存数周，或者以分装形式在-20℃ 下保存长达1年。
nonidet-p40 (np40)缓冲液
150 mm nacl
1.0% np40（可用0.1% triton x-100替代）
50 mm tris-hcl ph 8.0
蛋白酶抑制剂（一定要添加，推荐cocktail形式的，货号a10004）
ripa缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液）
150 mm nacl
1.0% np-40或0.1% triton x-100
0.5%脱氧胆酸钠
0.1% sds（十二烷基硫酸钠）
50 mm tris-hcl ph 8.0
蛋白酶抑制剂（一定要添加，推荐cocktail形式的，货号a10004）
tris-hcl缓冲液
20 mm tris-hcl ph 7.5
蛋白酶抑制剂（一定要添加，推荐cocktail形式的，货号a10004）
电泳、转膜、封闭缓冲液
laemmli 2×缓冲液/上样缓冲液
4% sds
20%甘油
0.004%溴酚蓝
0.125 m tris-hcl
测定ph并调节至ph 6.8。
电泳缓冲液（tris-ganansuan/sds）
25 mm tris碱
190 mmganansuan
0.1% sds
测定ph，ph应为约8.3。必要时进行调节。
转膜缓冲液（湿转）
25 mm tris碱
190 mm ganansuan
20%甲醇
测定ph，ph应为约8.3。必要时进行调节。
对于大于80 kda的蛋白质，推荐加入最终浓度为0.1%的sds。
转膜缓冲液（半干转）
48 mm tris
39 mmganansuan
20%甲醇
0.04% sds
封闭缓冲液
5%奶粉（推荐使用，也可以用bsa牛血清白蛋白）
加入tbst缓冲液中。混匀并过滤。过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒
会在显色过程中污染印迹。
实验步骤
a.制备细胞裂解物
1.吸干培养基。添加含有调节分子的新鲜培养基，使其在预定的时间内对细胞进行处理。
2.收集细胞，去除培养基后用冰预冷的1x pbs洗涤细胞一次。
3.去除pbs，并在并在细胞培养容器中加入适量的已经添加了cock tail蛋白酶抑制剂的
lysis buffer。每107个细胞加入1ml冰预冷的lysis buffe（相当于100mm的培养皿，150cm2
的培养瓶），并在冰上孵育至少5分钟。
4.从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5.在冰上进行3次超声破碎，每次5秒。如果没有超声仪，请用带注射器的针头(20g-18g-
16g)冰上反复抽吸，直到裂解液澄清；
6.在4°c，在14,000 x g条件下，微量离心10分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°c。
注：细胞裂解物制备好之后，可先进行蛋白免疫印迹法检测，以此来确定细胞裂解物里存在
目标蛋白。
b.抗原抗体结合
1.在新的离心管内加入500μl（含总蛋白200-1000ug）细胞裂解物。
2.加入目标蛋白的单克隆/多克隆抗体（1-10μg，根据抗体使用说明书）。
3.同时采用非特异免疫的同源抗体作为对照。
4.在4℃轻柔混合过夜。
c.免疫复合物沉淀
1.抗体孵育过夜后，加入20μl protein a/g。
2.在4℃温和地混匀1-3小时或过夜。
3. 12000g离心1min，保留沉淀。
4.使用0.5ml 1*wash buffer清洗沉淀，12000g离心1min，保留沉淀。
5.重复第4步，共计清洗3次。
注：清洗，去上清的时候需要注意避免吸走填料
d.用蛋白免疫印迹法进行分析
1.在20-50μl 1* sds样品缓冲液中重悬沉淀物。涡旋振荡，然后再微量离心30秒。
2.将样品加热至95–100°c并持续2-5分钟，然后在14,000 x g下瞬时离心1分钟。
3.将样品(15-30μl)上样到sds-page凝胶上。
4.用蛋白质印迹法分析样品。
如果抗体轻重链污染会影响结果分析，可选择abmart的避重轻链二抗来解决这个问题，产品货号：m20014-m20018