实验室常用 dna聚合酶有三种：taqtm，extaqtm和pyrobesttm dna polymerase。taqtm是一般的dna 聚合酶，保真性较差，但价钱便宜， 一般用于基因表达的检测等。takaraextaqtm 是具有proofreading活性的耐热性dna聚合酶，具有一定的保真性， 而且其扩增得到的pcr 产物3’ 端附有一个“a”碱基，如果希望直接将产物克隆到t-vector可以用此酶。pyrobesttmdna polymerase也是具有proofreading活性的耐热性dna聚合酶，其特点是保真性高，扩增得到的pcr 产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。
1. 按下列组成在pcr 反应管中调制反应液：
takarataqtm 或takaraextaqtm的配方
reagent
quantity,for50µlofreaction mixture
10x pcr buffer（mg2+free）
5µl
mgcl2（25mm）
如takara taqtm 加3µl
如takaraextaqtm 加4µl
2.5mm dntp mix
4µl
10µmprimer上游
1µl
10µm primer下游
1µl
templatedna
1µl
taq 或extaqdna polymerase
0.25µl
steriledeionizedwater
upto50µl
total
50µl/sample
merase的配方
reagent
quantity,for50µlofreaction mixture
10x pyrobestbuffer
5µl
2.5mm dntp mix
4µl
10µm primer上游
1µl
10µmprimer下游
1µl
templatedna
1µl
pyrobesttmdna polymerase
0.25µl
steriledeionizedwater
upto50µl
total
50µl/sample
① 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl以节约试剂；
② 将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的pcr 薄壁管中；
③ 如果不用pcr仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 ~50µl的矿物油防止样品在pcr 的过程中蒸发；
2. 按以下程序进行pcr 扩增。
pcr 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及pcr 结果而进行优化。
step
temperature,
°c
time,min
numberof
cycles
note
起始变
性
94~95
1-3
1
变性
94~95
0.5-2
25-35
退火温度比理论退火温度大概低 5°c，再
根据反应结果优化
退火
37-70
0.5-2
延伸
70-75
根据扩增产物
的大小
每分钟延伸1000bp
最终延
伸
70-75
10
1
反应结束后，抽取扩增样品 5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用dna marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
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