色谱载体的类型（整体柱、树脂、膜等）、固相载体介质和使用的流动相，都会影响到分离成功与否。选择正确的工具和条件组合会带来想要的结果。然而，还有其他因素，如柱温、流动相制备的准确性以及最重要的柱平衡，这些因素对于最佳分离至关重要，但很容易被忽视，尤其是最后一个因素。
primas和qa介质采用梯度洗脱（分别为电导率和ph值）方式来分离空衣壳和实衣壳。由于这种分离是基于两者之间微小的衣壳差异，因此会对色谱参数的微小变化很敏感。尤其是如果整个过程由多人操作时，其中一些参数可能不明显且分析后难以确定。为了建立认知，本文使用primas介质作为模型评估了其中的几个因素。此外，本文还说明了为什么使用电导率和 ph检测器对于理解样品结果之间的不一致性非常重要。
这些结果也可考虑应用于qa介质及其他介质，然而结果会有一定程度的变化。
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实验方法
使用0.2 ml primastm整体柱进行方法开发，用aav 2/8血清型样本进行检测。为了评估色谱参数，从色谱图中获取空衣壳和实衣壳的保留时间和洗脱ph值向样品中加入色氨酸，将其作为一种非结合示踪剂（流穿峰）。
patfix® hplc系统用于色谱实验
检测器：
ph和电导率
荧光（ex/em：280/348 nm）
缓冲液组成（ph梯度）：
缓冲液a：10 mm btp、10 mm（tris）、2 mm氯化镁（mgcl2）、1%山梨醇、0.1% poloxamer188，ph 8.00
缓冲液b：10 mm btp、10 mm（tris）、10 mm氯化钠（nacl）、2 mm 氯化镁（mgcl2）、1%山梨醇、0.1% poloxamer188，ph 9.50
梯度：从100%缓冲液a到100%缓冲液b，5.0分钟梯度。
cip和柱平衡：10 cv 0.1 m（naoh）和1 m氯化钠（nacl）；30 cv 0.1 m乙酸和1 m氯化钠，ph 5；20 cv双蒸水（ddh2o）；20 cv缓冲液a；20 cv缓冲液b；40 cv缓冲液a
结果
温度变化对空衣壳（e）/ 实衣壳（f）分离的影响:
图1: 在23℃、26℃和30℃三种不同温度下进行的aav空衣壳/实衣壳分离的色谱图
温度升高会显著提高空衣壳和实衣壳之间的分辨率，但也会影响保留时间（图 1）。虽然潜在的机制很多，但较高的温度确实会增加分子动能，进而影响分子-分子和分子-整体柱相互作用。
为了成功应用，需了解aav结合特性（电导率、ph、t）并保持温度稳定。使用柱温箱对于提供可重现的色谱柱性能至关重要。然而我们在使用制备柱时确实需要注意这一点，它对于可重现性分析至关重要。
如果要将缓冲液置于恒温箱中，则可对其进行预热，或可以在进入色谱柱之前使用金属线圈进行预热。有些缓冲液比其他缓冲液更值得注意，因为它们的ph值容易受温度影响（如tris）。其他应用场景也是如此，如pdna同种型分离非常依赖温度。
还必须控制柱温。最重要的是，冷藏过的色谱柱，应该将它预热到工作条件。
使用primas柱时效果可观，但在使用cimac aav full/empty（qa基质）柱时也观察到效果显著。
缓冲液制备影响空衣壳/实衣壳分离:
图2: 使用ph 8.00±0.05的缓冲液a进行aav空衣壳/实衣壳分离的色谱图
缓冲液制备对分离性能有影响（图 2）。ph 和电导率都是色谱方法优化的关键因素，因此应该严格控制。现有例子显示了 ph 值变化对分辨率和保留时间的影响。在某些情况下，影响可能比图 2 中观察到的更大。
虽然如图所示分析了 ph 值的影响，但电导率也非常重要。滴定过程中 ph 值被过度校正（ph 值降到目标值以下必须重新调高）时要注意。这会增加离子浓度，因此尽管达到了正确的 ph 值，但仍增加了电导率。在这种情况下，丢弃缓冲液并重新开始配制新缓冲液可减少阻碍。这适用于使用 primas、qa 和其他基质整体柱时。
要了解并控制 ph 值及电导率对色谱分离的影响，使用 ph 计尤其是电导率检测器至关重要。缺乏此类知识会使我们变得盲目，并在分析不可重现性或其他异常现象背后原因时很难提供指导。
对于 primas，ph 值的精度必须达到 1%，才能获得可重现的结果。这可通过使用精确质量标准化 的1 m hcl 调节 ph 值来实现。
柱平衡对空衣壳/实衣壳分离的影响
图3: 不同柱平衡条件下进行aav空衣壳/实衣壳分离的色谱图
在使用制备型色谱或分析型色谱时，为了获得可重现的结果和更大化峰分辨率而采取的较简单预防措施，也是往往被忽视的一种：色谱柱平衡。很容易观察到并再次显示在图3 中，如果色谱柱未完全平衡，峰之间的分辨率会显著降低。无论是离子交换(qa)色谱柱还是混合模式色谱柱，如 primas（离子交换与氢键结合），为了适当的样品结合来准备色谱柱是不可少的。
在进行分析时，电导率和ph检测器将帮助我们确认色谱柱是否已平衡。最好标志是与空白样品相比，电导率和 ph 信号接近基线。柱平衡后的推荐步骤是在注入样品之前上至少 3 个空白样品（或直到所有信号轨迹在运行之间可重现）。
对于制备型色谱，这主要取决于柱出口处的 ph 和电导率信号是否与柱前测量值相匹配。
开始开发使用色谱柱时严格按照说明书进行。在此过程的后期，可以根据经验优化柱平衡条件（减少特定缓冲液的 cv，或例如在平衡期间过渡到静态保持步骤——没有流速以节省缓冲液）。
值得注意的是需要在原位清洗（cip）后中和色谱柱，尤其是在使用不同浓度的 naoh 时。使用 1 m 乙酸钠或选择等同强度缓冲液（如在方法本身中使用的缓冲液）。继续用去离子水洗涤。之后，将平衡缓冲液用于新的色谱运行或用于作为长期储存的储存溶液。此步骤对于获得最佳柱效至关重要。如需精确的分步指导，请搜索随附的说明手册。
系统空隙体积的影响
图4: 空衣壳/实衣壳aav分离色谱图：基于检测器dt(ph-fld)的延迟
空隙体积在解释和评价色谱参数时起着重要作用，特别是在高空隙体积系统上运行小色谱柱时，空隙体积的影响会更加显著。图 4显示了ph及荧光检测器的延迟——分析物首先通过ph检测器，再通过荧光检测器。如果采用检测器dt(ph-fld)校正，则可获得更准确的结果。
必须考虑方法进程指示信号（例如电导率和 ph 值）与 uv、荧光或 mals 信号之间的色谱系统配置延迟。
结论
为了在cimac primas™和cimac aav full/empty色谱柱上进行可重现性的aav空衣壳/实衣壳分离，重要的是：
· 控制色谱柱、流动相和样品温度。对于色谱柱和流动相，请使用恒温箱。或在色谱柱前使用金属线圈在流动相流到色谱柱时对其进行加热（这只会加热缓冲液，对色谱柱本身作用不大）。进样前恒温样品。
· 准备缓冲液时要注意精度。设置可接受的误差以减少不受控制的波动。
· 平衡色谱柱。好的起点是遵循应用手册并根据经验进行优化。
· 考虑色谱配置条件并考虑在信号上观察到的任何延迟。
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