中华人民共和国国家标准
gb 5009.259-2023
食品安全国家标准食品中生物素的测定
前言
本标准代替gb 5009.259-2016《食品安全国家标准食品中生物素的测定》。
本标准与gb 5009.259-2016相比，主要变化如下：
——增加了第一法液相色谱-串联质谱法，微生物法调整为第二法；
——第二法微生物法增加了微孔板培养法；
——修改了标准的适用范围样品类别和前处理方法；
——修改了标准曲线和样品提取液制备的表述方式；
——修改了检出限、定量限和线性范围。
1范围
本标准规定了食品中生物素的测定方法。
第一法液相色谱-串联质谱法适用于调制乳粉、特殊膳食用食品中生物素的测定。
第二法微生物法适用于食品中生物素的测定。
第一法液相色谱-串联质谱法
2原理
试样经溶解提取，对含淀粉试样经淀粉酶酶解后，经蛋白沉淀、离心过滤后，c18反相色谱柱分离，采用液相色谱-串联质谱多离子反应监测方式检测，同位素稀释内标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
3.1试剂和材料
3.1.1甲酸(hcooh)：色谱纯。
3.1.2乙腈(ch3cn)：色谱纯。
3.1.3乙醇(ch3ch2oh)：色谱纯。
3.1.4甲酸铵(hcoonh4)：色谱纯。
3.1.5高氯酸(hclo4)：70%~72%。
3.1.6氢氧化钠(naoh)：纯度≥99.9%。
3.1.7淀粉酶：taka-淀粉酶，cas：9001-19-8，酶活≥100 u/mg。
3.2试剂配制
3.2.1 0.1%甲酸-10 mmol/l甲酸铵水溶液：称取0.63 g甲酸铵，用100 ml水溶解后，转移至1 000 ml试剂瓶中，加入1 ml甲酸，以水稀释至1 000 ml，摇匀备用。
3.2.2氢氧化钠溶液(2 mol/l)：称取8.00 g氢氧化钠于烧杯中，加入100 ml水溶解，摇匀备用。
3.2.3乙醇溶液(50%)：准确量取500 ml乙醇于1 000 ml试剂瓶中，以水稀释至1 000 ml，摇匀备用。
3.3标准品
3..3.1生物素标准品(c10h16n2o3s)：cas：58-85-5，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2生物素-d4(c10d4h12n2o3s)：cas：1217850-77-5，纯度≥98%。
3.4标准溶液配制
3.4.1生物素标准储备液(100μg/ml)：根据纯度换算精确称取10.00 mg生物素标准品(精确至0.01 mg)，用乙醇溶液(50%)溶解、定容至100 ml。溶液转移至棕色玻璃瓶中，-20℃下密封保存，有效期3个月。
3.4.2生物素标准中间液(10μg/ml)：准确吸取5.00 ml生物素标准储备液(100μg/ml)至50 ml容量瓶，用乙醇溶液(50%)定容至50 ml。溶液转移至棕色玻璃瓶中，-20℃下密封保存，有效期3个月。
3.4.3生物素标准中间液(1μg/ml)：准确吸取1.00 ml生物素标准中间液(10μg/ml)至10 ml容量瓶，用乙醇溶液(50%)定容至10 ml。溶液转移至棕色玻璃瓶中，-20℃下密封保存，有效期3个月。
3.4.4生物素标准工作液( 100 ng/ml)：准确吸取1.00 ml标准中间液(1μg/ml)，用流动相a定容至10 ml。溶液转移至棕色玻璃瓶，4℃下密封保存，有效期1个月。
3.4.5生物素标准工作液(10 ng/ml)：准确吸取1.00 ml生物素标准工作液(100 ng/ml)，用流动相a定容至10ml。临用现配。
3.5同位素内标溶液配制
3.5.1生物素-d4同位素内标储备液(100μg/ml)：准确称取10.00 mg(精确至0.01 mg)生物素内标，以乙醇溶液(50%)溶解、定容至100 ml。溶液转移至棕色玻璃瓶中，-20℃下密封保存，有效期3个月。
3.5.2生物素-d4同位素内标工作液(1μg/ml)：准确吸取1.00 ml标准储备液( 100μg/ml)，用流动相a定容于100ml。临用现配。
3.6标准系列工作液配制
分别准确吸取适量生物素标准工作液于10ml容量瓶中，准确加入生物素-d4同位素内标工作液(1μg/ml)150μl，用流动相a定容至刻度，使标准系列生物素的质量浓度分别为1.0 ng/ml、2.0 ng/ml、5.0 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml和25 ng/ml，每个系列溶液中同位素的质量浓度为15 ng/ml。临用现配。
4仪器和设备
4.1液相色谱串联质谱仪。
4.2天平：感量分别为0.001 g和0.01 mg。
4.3恒温水浴锅：25℃~100℃。
4.4 ph计：精度0.01。
4.5超声波振荡器。
4.6涡旋混合器：600 r/min~3 200 r/min。
4.7高速离心机：≥10 000 r/min。
4.8 2mm孔径试验筛(选用)。
4.9恒温培养箱：25℃~100℃。
5分析步骤
5.1样品制备
5.1.1固体样品
采样量需大于0.5kg。非均匀样品用高速粉碎机将其粉碎至全部通过2mm孔径试验筛，混合均匀后缩分至100g，储存于广口瓶中，密封保存，供检测用。均匀性样品直接混匀，供检测用。
5.1.2半固体样品
采样量需大于0.5 kg。需至少采集3个包装(同一批次)，将所有样品在一个容器中匀浆混匀后，其中任意的100 g储存于广口瓶中，密封保存，供检测用。
5.1.3液体样品
采样量需大于0.5 l。需至少采集3个包装(同-批次)，将所有样品在一个容器中混匀后，其中任意的100ml储存于广口瓶中，密封保存，供检测用。
5.2样品前处理
5.2.1不含淀粉试样
准确称取样品2 g~5 g(精确至0.001 g)，置于50 ml离心管中，加入750μl同位素内标工作液后，加入30ml温水(35℃~40℃)，振荡混匀，超声提取15min。取出后迅速冷却至室温，用高氯酸调节ph约为1.6。在4℃下，以8500 r/min离心10 min，经玻璃纤维过滤后用氢氧化钠溶液调节ph为4.6±0.1，样液转移至50 ml容量瓶，用水定容至刻度，混匀后移取1.5 ml提取液至2 ml离心管中，在10 000 r/min下离心10 min，样品溶液经0.22μm水系滤膜过滤，上机分析。
5.2.2含淀粉试样
准确称取样品2g~5 g(精确至0.001 g)，置于50 ml离心管中，加入1%样品量的淀粉酶，750μl同位素内标工作液后，加入30 ml温水(35℃~40℃)，振荡混匀，放置50℃~60℃培养箱内约30 min，取出后超声提取15 min。取出后迅速冷却至室温，用高氯酸调节ph约为1.6。在4℃下，以8 500 r/min离心10 min，经玻璃纤维过滤后用氢氧化钠溶液调节ph为4.6±0.1，样液转移至50 ml容量瓶，用水定容至刻度，混匀后移取1.5 ml提取液至2 ml离心管中，在10 000 r/min下离心10 min，样品溶液经0.22μm水系滤膜过滤，上机分析。
5.3仪器测定参考条件
5.3.1色谱参考条件如下：
a)色谱柱：c18柱(柱长100 mm，柱内径2.1 mm，填料粒径1.7μm)，或相当者；
b)流动相a为0.1%甲酸-10 mmol/l甲酸铵水溶液；流动相b为乙腈；
c)流速：0.3 ml/min；
d)柱温：35℃；
e)进样体积：10μl；
f)梯度洗脱条件见表1。
5.3.2质谱参考条件如下：
a)电离模式：esi+；
b)监测方式：多离子反应监测(mrm)，参数见表2；
c)毛细管电压：3.1 kv；
d)离子源温度：150℃；
e)辅助气温度：350℃；
f)辅助气流量：600 l/h~900 l/h。
5.4定性
试样中生物素的色谱峰的保留时间与相应标准溶液色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5%之内。
所选择的离子均出现，而且同一检测批次，样品中生物素的两个子离子的相对丰度与浓度相当的标准溶液的相对丰度相比，其允许偏差不超过表3规定的范围。生物素标准溶液质谱扫描图及mrm色谱图参见附录a。
5.5标准曲线的制作
将生物素标准系列工作液浓度由低到高依次注入液相色谱-串联质谱仪中，以生物素浓度与生物素内标浓度的比值为横坐标，以生物素与生物素内标峰面积比为纵坐标，绘制生物素的标准曲线。
6分析结果的表述
试样中生物素的含量按式(1)计算。
式中：
x——试样中生物素的含量，单位为微克每百克(μg/100 g)；
ρ——根据标准曲线计算得到的试样中生物素的质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
v——试样溶液的最终定容体积，单位为毫升(ml)；
n——试样的质量，单位为克(g)；
100——试样中量以每100克计算的换算系数；
1000——试样中ng转换成μg的换算系数。
结果保留3位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
8其他
当称样量为5.0 g时，定容体积为50 ml，方法的检出限为0.300μg/100 g，定虽限为1.00μg/100 g。
第二法微生物法
9原理
生物素是植物乳植杆菌(lacti plantibacillus plantarum)生长所必需的营养素，在生物素测定培养基中，植物乳植杆菌的生长与生物素的含量呈相关性，根据生物素含量与吸光度的标准曲线计算出试样中生物素含量。
10试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的二级水或一级水。
10.1菌株
植物乳植杆菌(lacti plantibacillus plantarum )[原植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)]atcc
8014，或等效菌株。
10.2培养基
10.2.1乳酸杆菌琼脂培养基：见附录b中b.1。
10.2.2乳酸杆菌肉汤培养基：见附录b中b.2。
10.2.3生物素测定用培养基：见附录b中b.3。
注：可使用商品化的合成培养基，按照说明书操作。
10.3试剂
10.3.1无水乙醇(cz hsoh)。
10.3.2硫酸(h2so4)：95%~98%。
10.3.3氢氧化钠(naoh)。
10.3.4氯化钠(nacl)。
10.4试剂配制
10.4.1乙醇溶液(50%)：量取500 ml无水乙醇，加入水中，定容至1 000 ml。
10.4.2硫酸溶液a(3.0 mol/l)：量取163.2 ml硫酸，加入水中，定容至1 000 ml。
10.4.3硫酸溶液b(1.0 mol/l)：量取54.4 ml硫酸，加入水中，定容至1 000 ml。
10.4.4硫酸溶液c(0.5 mol/l)：量取27.2 ml硫酸，加入水中，定容至1 000 ml。
10.4.5氢氧化钠溶液a(10 mol/l)：称取400 g氢氧化钠，加入水中，溶解定容至1 000 ml。
10.4.6氢氧化钠溶液b(0.1 mol/l)：吸取10 ml氢氧化钠溶液a(10 mol/l)，加水定容至1 000 ml。
10.4.7无菌生理盐水：称取8.5 g氯化钠溶于1 000 ml蒸馏水中，分装于具塞试管，每管10 ml，121℃下高压灭菌15 min。
注：配制硫酸溶液时，要在通风橱中配制，戴手套注意安全，将浓硫酸缓慢注入水中，并不断搅拌。
10.5标准品
生物素标准品(c10h16n2o3s)：cas号为58-85-5，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.6标准溶液配制
10.6.1生物素标准储备液(100μg/ml)：将生物素标准品置于含五氧化二磷的干燥器中，干燥过夜。按纯度称取，使生物素含量为50 mg(精确至0.1 mg)，用乙醇溶液(50%)溶解定容至500 ml。
10.6.2生物素标准中间液(1μg/ml)：吸取1.00 ml生物素标准储备液(100μg/ ml)至100 ml容量瓶，用乙醇溶液(50%)定容。
10.6.3生物素标准使用液(10 ng/ml)：吸取1.00 ml标准中间液(1μg/ml)至100 ml容量瓶，用乙醇溶液(50%)定容。
10.6.4生物素标准曲线工作液：分两个浓度，高浓度溶液的浓度为0.2ng/ml；低浓度溶液的浓度为0.1 ng/ml。从使用液中(10 ng/ml)吸取2次各5.00 ml，用水分别定容到250 ml和500 ml。
注：所有标准溶液要用棕色试剂瓶冷藏于冰箱内(2℃~8℃)，标准储备液保存期12个月，中间液保存期6个月，标准使用液临用现配。
11仪器和设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。
11.1分析天平：感量分别为0.001 g和0.1 mg。
11.2离心机：3 000 r/min~5 000 r/ min。
11.3涡旋混合器。
11.4 ph计：精度为0.01。
11.5恒温培养箱：36℃±1℃。
11.6分光光度计：540 nm~660 nm。
11.7酶标仪：540 nm~660 nm。
11.8冰箱：2℃~8℃。
11.9无菌微孔板。
11.10定量滤纸：直径90 mm。
11.11试管：18 mm×180 mm。
11.12容量瓶：容量100 ml、250 ml和500 ml。
11.13单刻度移液管：1 ml、5 ml和10 ml。
11.14刻度吸管：5 ml (具0.1 ml刻度)。
11.15玻璃漏斗：直径100 mm。
11.16锥形瓶：容量250 ml。
11.17烧杯：容量100 ml。
11.18分液器：0 ml~10 ml。
11.19微量移液器：1 000μl和200μl。
11.20无菌离心管：1.5 ml。
11.21针头过滤器：孔径0.22μm。
注：清洗后的玻璃器皿和金属器具应在200℃~250℃下干热1h~2h。
12分析步骤
12.1测试菌悬液制备
12.1.1用接种针将植物乳植杆菌菌株穿刺转接至乳酸杆菌琼脂培养基中，36℃±1℃培养20 h~24 h，取出后放入冰箱中冷藏保存，可保存1个月。每月至少传种1次，作为储备菌株保存。
12. 1.2将储备菌株接种至乳酸杆菌琼脂培养基中，36℃±1℃培养20 h~24 h以活化菌株，用于接种液的制备。保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，试验前应连续传种2代~3代以保证菌株活力。
12.1.3将24h内活化后的菌株转种至已灭菌的乳酸杆菌肉汤中，36℃±1℃培养16h~20h。取出后将菌悬液离心弃去。上清液，加入10 ml生理盐水，用涡旋混合器振荡该悬液，以3 000 r/min~5 000 r/min离心5 min，弃去上清液。重复前述操作清洗2次~3次后，再加10 ml生理盐水，充分混合均匀。吸取适量该菌悬液于10ml生理盐水中，混匀制成测试菌悬液。
12.1.4以生理盐水做空白，用分光光度计于550 nm波长下测定测试菌悬液透光率t(%)，调整上述菌液加入量，使测试菌悬液透光率在60%~80%。
12.2试样提取
注：块状、颗粒状试样需粉碎；乳粉、米粉等粉状试样需混匀；果蔬、肉、蛋、鱼、动物内脏等需制成食糜；半固体食品等试样需匀浆混匀；液体试样用前振摇混合。
12.2.1固态试样：准确称取试样(精确至0.001 g)，置于250 ml锥形瓶中，其中新鲜果蔬试样2 g~5 g；谷类、豆类、坚果类、内脏、生肉、干制试样0.2 g~1 g；特殊膳食用食品1 g~3 g；乳粉、米粉等试样2 g~3 g；一般营养素补充剂或其他食品0.2 g~1 g。
12.2.2液体饮料或流质、半流质试样：称取试样5g~10g(或用单刻度移液管吸取适量体积)，置于250ml锥形瓶中。特殊运动饮料称取样品后不需处理，称样后直接定容至100 ml(v)，按12.2.4进行稀释。
12.2.3根据试样基质加入50 ml硫酸溶液：特殊膳食用食品、调制乳粉等强化食品加入硫酸溶液c(0.5mol/l)；植物源食品加入硫酸溶液b(1.0mol/l)；动物源食品加入硫酸溶液a(3.0mol/l)。
将上述混合物放入压力蒸汽灭菌器，121℃下水解30min，取出迅速后水浴冷却至室温。用氢氧化钠溶液a和氢氧化钠溶液b调节ph为4.5±0.2，移入250 ml容量瓶中，用水定容至刻度(v；)。用定量滤纸过滤，最初约10 ml滤液应弃去，吸取5 ml(v2)滤液于100 ml烧杯中，用氢氧化钠溶液b调节ph为6.8±0.2，移入100 ml容量瓶中，用水定容至刻度(v)。
12.2.4稀释：根据试样中生物素含量用水对提取液进行适当稀释(f)，使稀释后试样提取液中生物素质量浓度为0.1 ng/ml~0.2 ng/ml。
12.3试样测定
12.3.1试管培养法
12.3.1.1标准曲线系列管
按表4顺序加入水、标准曲线工作液和生物素测定用培养基于培养管中，表4中每一编号需制作3管。未接种空白试管(un)、接种空白试管(in)、标准系列管s1~s8中生物素质量浓度分别为0 ng/ml、0 ng/ml、0.1 ng/ml、0.2 ng/ml、0.3 ng/ml、0.4 ng/ml、0.5 ng/ml、0. 6 ng/ml、0.8 ng/ml和1.0 ng/ml。
12.3.1.2试样系列管
按表5顺序加入水、试样提取液和生物素测定用培养基于培养管中，表中每一编号需制作3管。每份样品需制作样品空白试管1只，管内分别加入5 ml试样提取液和5 ml培养基。
12.3.1.3灭菌
将试样空白管，标准曲线系列管和试样系列管放入压力蒸汽灭菌器，121℃下灭菌5 min，取出后迅速水浴冷却至室温。为了保证加热和冷却过程中温度均匀，灭菌试管不应距离灭菌器内壁过近，试管摆放不应过密，以免影响空气流通。
12.3.1.4接种
在无菌条件下，向.上述每管中(样品空白管和标准曲线未接种空白管un除外)各加入1滴
(50μl~100μl)测试菌液，加盖，充分振荡混匀所有试管。
12.3.1.5培养
将试管放入恒温培养箱内，36℃±1℃下培养18 h~24 h。
12.3.1.6测定
培养结束后，对每支试管进行目测检查，未接种空白试管(un)内培养液应是澄清的，标准曲线系列管和试样系列管中培养液的浓度应有梯度差别。未接种空白试管(un)若浑浊，则测定无效。
12.3.1.6.1用未接种空白试管(un)做空白，将分光光度计吸光度(a)调至0%，读出接种空白试管(in)的读数。再以接种空白试管(in)为空白，调节吸光度为0%。
12.3.1.6.2用涡旋混合器充分混合每支试管，立即将培养液移入比色皿内，在550 nm波长下测定吸光度。待读数稳定后，读出吸光度数值，每支试管稳定时间要相同，依次读出其他试管的吸光度。吸光度超出标准曲线管s1~s8范围的培养管要舍去。
以生物素标准品的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
12.3.1.6.3样品空白管的吸光度要一并读出。若样品空白管吸光度大于0.02，加入试样提取液1 ml的培养管的吸光度值要减去其样品空白管吸光度值的1/5，加入试样提取液2ml的培养管的吸光度值要减去其样品空白管吸光度值的2/5，以此类推，作为计算结果的依据。
12.3.2微孔板培养法
12.3.2.1标准曲线系列离心管
将生物素标准曲线工作液在无菌条件下过滤除菌至无菌离心管中，按表6标准溶液的制备方式，制备3套标准曲线系列离心管。未接种空白孔(un)、接种空白孔(in)、s1~s8中生物素浓度与试管法相同。
12.3.2.2试样系列离心管
先将试样稀释液无菌条件下过滤除菌，按表7试样提取液的制备方式，制备3套试样系列离心管。
12.3.2.3接种和培养
生物素测定培养基灭菌冷却后(或者无菌条件下过滤除菌)，每10 ml培养基中加入测试菌悬液100μl~200μl，混匀，吸取150μl加入微孔板中。un(未接种空白)使用未加入菌悬液的培养基。从标准曲线系列离心管和试样系列离心管吸取150μ山加入微孔板中，覆膜，置于恒温培养箱中36℃±1℃下培养18h~24 h。
12.3.2.4测定
培养结束后，对每个孔进行目测检查，未接种空白孔(un)内培养液应是澄清的，标准曲线孔和试样孔中培养液的浓度应有梯度差别。将微孔板置于酶标仪内，540 nm~550 nm (或者610 nm~630 nm)选择稳定波长测定吸光度。未接种空白孔(un)吸光度值应小于0.1，否则测定无效。记录吸光度读数，数据处理同试管培养法。
12.3.3生物素合量的计算
对每个编号的试样提取液的培养管，用每支试管的吸光度计算每毫升该编号提取液生物素的浓度，并计算该编号提取液的生物素浓度平均值，每支试管测得的该浓度不得超过该平均值的±15%，超过者要舍去。如果符合该要求的管数少于所有的4个编号的提取液的总管数的2/3，用于计算试样含量的数据是不充分的，需要重新检验。如果符合要求的管数不少于原来管数的2/3，重新计算每一编号的有效试样管中每毫升提取液中生物素含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值为ρ，按式(2)根据稀释倍数和称样量计算出试样中生物素的含量。
注：可使用与本标准检测原理相同且经等效验证的生物素检测试剂盒。
13分析结果的表述
试样提取液生物素的质量浓度按式(2)计算。
式中：
ρx——试样提取液生物素的质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
cx——标准曲线上查得试样系列管中生物素的质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
vx——制备试样系列管时吸取的试样提取液体积，单位为毫升(ml)。
试样中生物素的含量按式(3)计算。
式中：
x——试样中生物素的含量，单位为微克每百克(μg/100 g)或微克每百毫升(μg/100 ml)；
ρ——计算所得的试样提取液中生物素质量浓度的总平均值，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
v——试样提取液的定容体积，单位为毫升(ml)；
n——试样的质量或体积，单位为克(g)或毫升(ml)；
v1——过滤前的定容体积，单位为毫升(ml)；
v2——过滤后吸取滤液的体积，单位为毫升(ml)；
f——试样提取液稀释倍数；
100——-换算系数；
1 000——换算系数。
结果保留3位有效数字。
注1：对于不需要提取的样品，式中去除v1和v2。
注2：如果样品中生物素含量较高，可适当进一步稀释；如果含量较低可适当提高样品称样量或降低稀释倍数。
14精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
15其他
15.1需要提取的样品：当称样量为2 g时，本标准定量限为2.5μg/100 g。
15.2特殊用途饮料等不需要提取的样品：当称样量为10 g时，定量限为0.1μg/100 g。