臭氧的灭菌属于生物化学氧化反应，臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶；也可直接与细菌、病毒发生作用，破坏其细胞壁和核糖核酸，分解dna、rna、蛋白质、脂质类和多糖等大分子聚合物，使细菌的物质代谢生长和繁殖过程遭到破坏；还可以渗透胞膜组织，侵入细胞膜内作用于外膜脂蛋白和内部的脂多糖，使细胞发生通透性畸变，导致细胞的溶解死亡，并且将死亡菌体内的遗传基因、寄生菌种、寄生病毒粒子、噬菌体、支原体及热原（细菌病毒代谢产物、内毒素）等溶解变性灭亡。纵观无菌技术对微生物作用的原理可分为抑菌、杀菌和溶菌三种，应用臭氧作灭菌剂是属于溶菌。
卫生部1991年颁布的《消毒技术规范》中，对臭氧的灭菌原理也有一段介绍：“科学研究表明，臭氧具有*的灭菌作用。”“臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧气（o2）和单个氧原子（o），后者具有很强的活性，对细菌有*的氧化作用。臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏细胞膜，将它杀死，多余的氧原子则会自行重新结合成为普通氧分子（o2），不存在任何有毒残留物，故称“无污染消毒剂”。它不但对各种细菌（包括肝炎病毒，大肠杆菌，绿浓杆菌及杂菌等）有*的杀灭能力，且对杀死霉菌也很有效。