一、实验目的1.熟练掌握小鼠胆管类器官原代建立技术。
2.了解掌握小鼠多种组织来源类器官原代建立技术。
3.观察记录小鼠胆管原代类器官生长、扩增过程中类器官形态的变化。
二、实验原理本实验策略采取从成体干细胞中建立和维持小鼠胆管类器官的方法。胆管上皮的自我更新是由位于肝脏的干细胞及其祖细胞的增殖所驱动的。小鼠胆管类器官表达胆管上皮在结构、细胞类型组成和自我更新动力学方面的所有标志，因此为小鼠肝脏发育和疾病的研究提供了巨大的希望。
三、实验仪器、材料、试剂1. 仪器：生物安全柜、细胞培养箱、低温水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱、摇床。
2. 材料：细胞培养板(规格为24孔、48孔和96孔)、离心管(规格为1.5ml、15ml和50ml)、细胞培养皿(直径规格为2.5cm和6cm)、移液器(规格为2.5μl、10μl、20μl、200μl、1000μl和5000μl)、无菌吸头(规格为10μl、200μl和1000μl)、无菌镊子、无菌组织剪。
3.试剂：小鼠胆管类器官培养试剂盒(ma-0817h009hl/s)、组织消化液(mb-0818l06s-100)、润洗液(mb-0818l03l/s)、基础培养基(mb-0818l07)、胎牛血清、dpbs、基质胶(082701/082703/082755)、红细胞裂解液(mb-0818l08l/s)。
四、实验内容与方法
01 实验前准备小鼠胆管类器官培养试剂盒(ma-0817h009hl/s)、基质胶(082701/082703/082755)4℃化冻；
小鼠胆管类器官培养基的制备：将200μl mouse liver ductal organoid supplementb (50x)，40μl mouse liver ductal organoid supplement c (250x) 加至9.76ml mouseliver ductal organoid basal medium中，充分混合，配制成10ml小鼠胆管类器官培养基，室温平衡，可在2-8°c储存，建议在两周内使用；
准备足量添加1%双抗的dpbs；
配制10ml组织消化液，现配现用，37℃摇床混匀预热，未用完消化液可-20℃保存1周（mogengel：10ml基础液+添加物500μl)。
02 组织样本收集小鼠断脊处死，表面喷洒酒精杀菌，在无菌条件下将胆管第一大肝叶取出，用刀片切下1/2肝叶，放入4℃预冷的dpbs溶液中。
03 组织清洗用冰冷的dpbs清洗2~3次，将组织转移到新的6cm培养皿或1.5ml ep管中，用无菌组织剪将组织剪成约0.5mm³的碎片。
04去除杂质细胞将剪碎的组织转移到15ml离心管中，并加入约10ml冰冷的basal medium。用5ml移液管上下吹打样品，以去除红血球和脂肪(它们会漂浮到溶液的顶部)。后让组织碎片沉降5~7分钟，并弃去约7.5ml的上清液，包括任何漂浮的脂肪， 后重复此洗涤步骤1~2次。
05消化液消化将剪碎的组织用适量的原代组织液消化液(mb-0818l06s-100)重悬，并转移至新的离心管内，于37℃，100rpm条件下的恒温振荡培养箱中，消化20-30分钟，每隔10分钟观察组织消化情况，待组织块明显分散，悬液较浑浊时，取适量组织消化悬液镜检，待悬液中有较多胆管结构即可终止消化，若组织碎块较大或消化不可适当延长消化时间。消化期间可以使用不同规格的移液器吹打组织消化悬液，帮助充分消化。
06终止消化在消化完成的组织悬液中加入胎牛血清（fetal bovine serum, fbs）至终浓度达1%~5%以减缓消化作用，同时轻轻吹打5~10次。
07静置收集静置3-10min，待组织碎片自然沉降后，将上清液转移至新的15ml离心管中，剩余组织碎片中加入1ml冰冷的basal medium吹打5~10次，静置1min待组织碎片自然沉降后，将上清收集至离心管中。在8℃下以250g的速度离心3min，弃去上清以洗去残留的消化液。若所获细胞沉淀呈红色，说明其中包含红细胞，则需在清洗前于沉淀中加入红细胞裂解液(mb-0818l08l/s)裂解红细胞，并于250g离心力离心3分钟，吸去上清液保留沉淀，再对沉淀进行清洗。
08类器官收集用含有抗生素的pbs或基础培养基(mb-0818l07)清洗细胞2次（混匀后250g离心力离心，3分钟，弃去上清液）以除去fbs。
09基质胶3d包裹将清洗后的细胞沉淀用含有抗生素的pbs或基础培养基重悬，取少量悬液进行活细胞检测和计数，并按照100,000~500,000个细胞/ml的密度加入细胞外基质（>70%）并在冰上混匀，混匀后置于冰上。
注意：混匀吹打的动作要轻柔，切忌产生大量气泡，常温混匀则需要控制在15秒内。
10种板培养用移液器吸取细胞外基质和细胞的混合液移至细胞培养孔板中，（如24孔细胞培养板每孔点20~30μl混合悬液，48孔板每孔点12.5~18μl混合悬液，96孔板孔板每孔点3~5μl混合悬液），混合悬液须点至培养孔底部中央位置，其铺开后不可接触培养孔侧壁。将培养板放入37℃，在5%co2细胞培养箱中孵育20分钟，待细胞外基质凝固至不再流动后，沿孔壁缓缓加入培养基，(如24孔板加500μl培养基，48孔板加250μl培养基，96孔板加100μl培养基)，p0代培养3~4天换液。
11持续培养将细胞培养板放入培养箱中进行培养，每1天于倒置显微镜下观察类器官的生长状态，每3天于倒置显微镜下拍照，记录多个视野中的类器官的形态和分布。
五、小鼠胆管类器官培养推荐试剂